6 概述
血清中的膽紅素大部分來源於衰老紅細胞被破壞後產生出來的血紅蛋白衍化而成，在肝內經過葡萄糖醛酸化的叫做直接膽紅素。直接膽紅素又稱結合膽紅素。未結合膽紅素在肝細胞內轉化，與葡糖醛酸結合形成結合膽紅素，結合膽紅素用凡登伯定性試驗呈直接反應，故將這種膽紅素稱爲直接膽紅素。膽紅素在肝細胞內經結合轉化後，從脂溶性轉變成水溶性，因而不易透過生物膜，這樣既具有解毒作用，又利用膽紅素從膽道中排泄。測定直接膽紅素主要用於鑑別黃疸的類型。結合膽紅素的升高，說明經肝細胞處理和處理後膽紅素從膽道的排泄發生障礙。
7 原理
血清中結合膽紅素可直接與重氮試劑反應，產生偶氮膽紅素；在同樣條件下，遊離膽紅素需有加速劑使膽紅素氫鍵破壞後與重氮試劑反應。咖啡因、苯甲酸鈉爲加速劑，醋酸鈉維持pH同時兼有加速作用。抗壞血酸（或疊氮鈉）破壞剩餘重氮反應，終止結合膽紅素測定管的偶氮反應，防止遊離膽紅素的緩慢反應。加入鹼性酒石酸鈉使最大吸光度由530nm轉移到598nm，非膽紅素的黃色色素及其他紅與棕色色素產生的吸光度降至可略而不計，使靈敏度和特異性增加。最後形成的綠色是由藍色的鹼性偶氮膽紅素和咖啡因與對氨基苯磺酸之間形成的黃色色素混合而成。
8 試劑
①咖啡因-苯甲酸鈉試劑：稱取無水醋酸鈉41.0g（或CH3COONa·3H2O 63.0g），苯甲酸鈉38.0g，乙二胺四乙酸二鈉（EDT-ANa2）0.5g，溶於約500ml蒸餾水中，再加入咖啡因25.0g，攪拌使溶解（加入咖啡因後不能加熱溶解），用蒸餾水補足至1000ml，混勻。用濾紙過濾，置棕色瓶，室溫保存。
②鹼性酒石酸鈉溶液：稱取氫氧化鈉75.0g，酒石酸鈉（Na2C4H4O6·H2O）263.0g，用蒸餾水溶解並補足至1000ml，混勻。置塑料瓶中，室溫保存。
③5.0g/L亞硝酸鈉溶液：稱取亞硝酸鈉（NaNO2）5.0g，用蒸餾水溶解並稀釋到100ml，混勻，置棕色瓶中，冰箱保存，穩定不少於3個月。作10倍稀釋成0.5g/L，貯冰箱穩定不少於2周。
④5.0g/L對氨基笨磺酸溶液：稱取對氨基苯磺酸（NH2C6H4SO3H·H2O）5.0g/L，溶於800ml蒸餾水中，加入濃鹽酸15ml，用蒸餾水補足至1000ml。
⑤重氮試劑：臨用前取5.0g/L亞硝酸鈉溶液0.5ml和5.0g/L對氨基苯磺酸溶液20ml混合。
⑥5.0g/L疊氮鈉溶液：稱取疊氮鈉0.5g，以蒸餾水溶解並稀釋至100ml。
⑦膽紅素標準液
A.一般用遊離（非結合）膽紅素配製標準液，因此配製標準液的稀釋劑需含白蛋白。可用牛血清白蛋白（40g/L）或人血清代替人血清白蛋白。後者方法如下：收集無溶血、無黃疸、無脂濁的新鮮血清，混合，必要時可用濾菌器過濾。取過濾後的血清1ml，加入24ml新鮮生理鹽水，混合。在414nm波長，1cm光徑，以生理鹽水調零點，其吸光度應小於0.100；在460nm的吸光度應小於0.04。
B.配製標準液的膽紅素須符合下列標準：純膽紅素的氯仿溶液，在25℃條件下，光徑10±0.01mm，波長453mm，摩爾吸光係數應在60700±1600範圍內；改良J-G法偶氮膽紅素的摩爾吸光係數應在74380±866。
C.膽紅素貯存標準液，171μmol/L（10mg/dl）：準確稱取符合要求的膽紅素10mg，加入1ml二甲亞碸，用玻璃棒攪拌，使成混懸液。加入0.05mol/L碳酸鈉溶液2ml，使膽紅素完全溶解，移入100ml容量瓶中，以稀釋用血清洗滌數次併入容量瓶中，緩慢加入0.1mol/L鹽酸2ml，邊加邊搖（勿用力，以免產生氣泡）。最後以稀釋用血清補足至100ml。配製過程中應儘量避光，貯存容器用黑紙包裹。置4℃冰箱3天內有效，但要求配後儘快作標準曲線。
9 操作方法
按表1操作。
充分混勻後，波長600nm，對照管調零，讀取各管吸光度；或用蒸餾水調零，讀取測定管及對照管吸光度，用測定管吸光度與對照管吸光度之差（AU-AC），在標準曲線上查出相應的膽紅素濃度。