2010年版藥典一部附錄Ⅵ

2010年版藥典附錄 色譜法 紙色譜法 薄層色譜法 柱色譜法 高效液相色譜法 氣象色譜法 毛細管電泳法 G離子色譜法

目錄

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn yī bù fù lù Ⅵ

中華人民共和國藥典》2010年版一部 附錄Ⅵ 色譜法

色譜法根據其分離原理可分爲:吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法與排阻色譜法等。吸附色譜法是利用被分離物質在吸附劑上吸附能力的不同,用溶劑氣體洗脫使組分分離;常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質。分配色譜法是利用被分離物質在兩相中分配係數的不同使組分分離,其中一相被塗布或鍵合在固體載體上,稱爲固定相,另一相爲液體或氣體,稱爲流動相;常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。離子交換色譜法是利用被分離物質在離子交換樹脂上交換能力的不同使組分分離;常用的樹脂有不同強度的陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂,流動相爲水或含有機溶劑緩衝液分子排阻色譜法又稱凝膠色譜法,是利用被分離物質分子大小的不同導致在填料上滲透程度不同使組分分離;常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等,根據固定相和供試品的性質選用水或有機溶劑作爲流動相。

色譜法又可根據分離方法分爲:紙色譜法薄層色譜法柱色譜法氣相色譜法高效液相色譜法等。所用溶劑應與供試品不起化學反應,純度要求較高。分離時的溫度,除氣相色譜法或另有規定外,係指在室溫操作。分離後各成分的檢測,應採用各品種項下所規定方法。採用紙色譜法薄層色譜法柱色譜法分離有色物質時,可根據其色帶進行區分;分離無色物質時,可在短波(254nm)或長波(365nm)紫外光燈下檢視,其中紙色譜或薄層色譜也可噴以顯色劑使之顯色,或在薄層色譜中用加有熒光物質的薄層硅膠,採用熒光猝滅法檢視。柱色譜法氣相色譜法高效液相色譜法可用接於色譜柱出口處的各種檢測檢測柱色譜法還可分部收集流出液後用適宜方法測定。

2 附錄Ⅵ A紙色譜法

紙色譜法系以紙爲載體,以紙上所含水分或其他物質爲固定相,用展開劑進行展開的分配色譜。供試品經展開後,可用比移值(Rf)表示其各組成成分的位置(比移值一原點中心至斑點中心的距離/原點中心至展開劑前沿的距離)。由於影響比移值的因素較多,因而一般採用在相同實驗條件下與對照物質對比以確定其異同。用作藥品鑑別時,供試品在色譜圖中所顯主斑點的位置與顏色(或熒光),應與對照品在色譜圖中所顯主斑點相同。用作藥品純度檢查時,可取一定量的供試品,經展開後,按各品種項下的規定,檢視其所顯雜質斑點的個數或呈色深度(或熒光強度)。進行藥品含量測定時,將色譜主斑點剪下經洗脫後,再用適宜的方法測定。

2.1 1.儀器與材料

2.1.1 (1)展開容器

通常爲圓形或長方形玻璃缸,缸上具有磨口玻璃蓋,應能密閉。用於下行法時,蓋上有孔,可插入分液漏斗,用以加入展開劑。在近頂端有一用支架架起的玻璃槽作爲展開劑的容器,槽內有一玻棒,用以壓住色譜濾紙;槽的兩側各支一玻棒,用以支持色譜濾紙使其自然下垂。用於上行法時,在蓋上的孔中加塞,塞中插入玻璃懸鉤,以便將點樣後的色譜濾紙掛在鉤上;併除去溶劑槽和支架。

2.1.2 (2)點樣器

常用具支架的微量注射器或定量毛細管,應能使點樣位置正確、集中。

2.1.3 (3)色譜濾紙

質地均勻平整,具有一定機械強度,不含影響展開效果的雜質}也不應與所用顯色劑起作用,以免影響分離和鑑別效果,必要時可進行處理後再用。用於下行法時,取色譜濾紙按纖維長絲方向切成適當大小的紙條,離紙條上端適當的距離(使色譜濾紙上端能足夠浸入溶劑槽內的展開劑中,並使點樣基線能在溶劑槽側的玻璃支持棒下數釐米處)用鉛筆劃一點樣基線,必要時,可在色譜濾紙下端切成鋸齒形便於展開劑滴下。用於上行法時,色譜濾紙長約25cm,寬度則按需要而定,必要時可將色譜濾紙捲成筒形;點樣基線距底邊約2.5cm。

2.2 2.操作方法

2.2.1 (1)下行法

將供試品溶解於適宜的溶劑中製成一定濃度的溶液。用定量毛細管或微量注射器吸取溶液,點於點樣基線上,溶液宜分次點加,每次點加後,俟其自然乾燥、低溫烘乾或經溫熱氣流吹乾,樣點直徑爲2~4mm,點間距離約爲1.5~2.0cm,樣點通常應爲圓形。

將點樣後的色譜濾紙的點樣端放在溶劑槽內並用玻棒壓住,使色譜濾紙通過槽側玻璃支持棒自然下垂,點樣基線在支持棒下數釐米處。展開前,展開缸內用各品種項下規定溶劑蒸氣使之飽和,一般可在展開缸底部放一裝有規定溶劑的平皿或將被規定溶劑潤溼的濾紙條附着在展開缸內壁上,放置一定時間,俟溶劑揮發使缸內充滿飽和蒸氣然後小心添加展開劑至溶劑槽內,使色譜濾紙的上端浸設在槽內的展開劑中。展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙移動進行展開,展開至規定的距離後,取出色譜濾紙,標明展開劑前沿位置,俟展開劑揮散後按規定方法檢測色譜斑點。

2.2.2 (2)上行法

點樣方法同下行法。展開缸內加入展開劑適量,放置俟展開劑蒸氣飽和後,再下降懸鉤,使色譜濾紙浸入展開劑約0.5cm,展開劑即經毛細管作用沿色譜濾紙上升,除另有規定外,一般展開至約15cm後,取出晾乾,按規定方法檢視。

展開可以單向展開,即向一個方向進行;也可進行雙向展開,即先向一個方向展開,取出,俟展開劑完全揮發後,將濾紙轉動90。,再用原展開劑或另一種展開劑進行展開;亦可多次展開、連續展開或徑向展開等。

3 附錄Ⅵ B薄層色譜法

薄層色譜法系將供試品溶液點於薄層板上,在展開容器內用展開劑展開,使供試品所含成分分離,所得色譜圖與適宜的對照物按同法所得的色譜圖對比,並可用薄層掃描儀進行掃描,用於鑑別、檢查或含量測定。

3.1 1.儀器與材料

3.1.1 (1)薄層板

市售薄層板 市售薄層板分普通薄層板和高效薄層板,如硅膠薄層板、硅膠GF254薄層板、聚酰胺薄膜等。

自制薄層板 在保證色譜質量的前提下,如需對薄層板進行特別處理和化學改性,以適應供試品分離的要求時,也可用實驗室自制的薄層板。最常用的固定相有硅膠G、硅膠GF254、硅膠H、硅膠HF254微晶纖維素等,其顆粒大小,一般要求粒徑爲10~40μm,加水或用羧甲基纖維素鈉溶液(0.2%~0.5%)適量調成糊狀,均勻塗布於玻板上。使用塗布器塗布應能使固定相在玻板上塗成一層符合厚度要求的均勻薄層。玻板應光滑、平整,洗淨後不附水珠。

3.1.2 (2)點樣器

一般採用微升毛細管或手動、半自動、全自動點樣器材。

3.1.3 (3)展開容器

上行展開一般可用適合薄層板大小的專用平底或雙槽展開缸,展開時須能密閉。水平展開用專用的水平展開缸。

3.1.4 (4)顯色裝置

噴霧顯色應使用玻璃噴霧瓶或專用噴霧器,要求用壓縮氣體使顯色劑呈均勻細霧狀噴出;浸漬顯色可用專用玻璃器械或用適宜的展開缸代用;蒸氣燻蒸顯色可用雙槽展開缸或適宜大小乾燥器代替。

3.1.5 (5)檢視裝置

爲裝有可見光、254nm及365nm紫外光光源及相應的濾光片的暗箱,可附加攝像設備供拍攝圖像用,暗箱內光源應有足夠的光照度

3.1.6 (6)薄層色譜掃描儀

係指用一定波長的光對薄層板上有吸收的斑點,或經激發後能發射出熒光的斑點,進行掃描,將掃描得到的譜圖和積分數據用於物質定性或定量的分析儀器。

3.2 2.操作方法

3.2.1 (1)薄層板製備

市售薄層板 臨用前一般應在110℃活化30分鐘。聚酰胺薄膜不需活化。鋁基片薄層板可根據需要剪裁,但須注意剪裁後的薄層板底邊的硅膠層不得有破損。如在存放期間被空氣中雜質污染,使用前可用三氯甲烷甲醇或二者的混合溶劑在展開缸中上行展開預洗,110℃活化,置乾燥器中備用。

自制薄層板 除另有規定外,將1份固定相和3份水(或加有黏合劑的水溶液)在研鉢中按同一方向研磨混合,去除表面的氣泡後,倒人塗布器中,在玻板上平穩地移動塗布器進行塗布(厚度爲0.2~0.3mm),取下塗好薄層的玻板,置水平臺上於室溫下晾乾後,在110℃烘30分鐘,即置有乾燥劑乾燥箱中備用。使用前檢查其均勻度,在反射光及透視光下檢視,表面應均勻、平整、光滑,無麻點、無氣泡、無破損及污染

3.2.2 (2)點樣

除另有規定外,在潔淨乾燥環境,用專用毛細管或配合相應的半自動、自動點樣器械點樣於薄層板上,一般爲圓點狀或窄細的條帶狀,點樣基線距底邊10~15mm,高效板一般基線離底邊8~10mm。圓點狀直徑一般不大於3mm,高效板一般不大於2mm;接觸點樣時注意損傷薄層表面。條帶狀寬度一般爲5~10mm。高效板條帶寬度一般爲4~8mm,可用專用半自動或自動點樣器械噴霧法點樣。點間距離可視斑點擴散情況以相鄰斑點互不干擾爲宜,一般不少於8mm,高效板供試品間隔不少於5mm。

3.2.3 (3)展開

將點好供試品的薄層板放入展開缸中,浸入展開劑的深度爲距原點5mm爲宜,密閉。除另有規定外,一般上行展開8~15cm,高效薄層板上行展開5~8cm。溶劑前沿達到規定的展距,取出薄層板,晾乾,待檢測

展開前如需要溶劑蒸氣平衡,可在展開缸中加入適量的展開劑,密閉,一般保持15~30分鐘。溶劑蒸氣平衡後,應迅速放入載有供試品的薄層板,立即密閉,展開。如需使展開缸達到溶劑蒸氣飽和的狀態,則須在展開缸的內側放置與展開缸內徑同樣大小的濾紙,密閉一定時間,使達到飽和再如法展開。必要時,可進行二次展開或雙向展開。

3.2.4 (4)顯色與檢視

供試品含有可見光下有顏色的成分可直接在日光下檢視,也可用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色,或加熱顯色,在日光下檢視。有熒光的物質或遇某些試劑可激發熒光的物質可在365nm紫外光燈下觀察熒光色譜。對於可見光下無色,但在紫外光下有吸收的成分可用帶有熒光劑的硅膠板(如硅膠GF254板),在254nm紫外光燈下觀察熒光板面上的熒光猝滅物質形成的色譜。

3.2.5 (5)記錄

薄層色譜圖像一般可採用攝像設備拍攝,以光學照片或電子圖像的形式保存。也可用薄層掃描儀掃描記錄相應的色譜圖。

3.3 3.系統適用性試驗

按各品種項下要求對實驗條件進行系統適用性試驗,即用供試品和對照品對實驗條件進行試驗和調整,應達到規定檢測靈敏度分離度和重複性要求。

3.3.1 (1)檢測靈敏度

用於限量檢查時,採用供試品溶液和對照品溶液與稀釋若干倍的對照品溶液規定的色譜條件下,於同一薄層板上點樣、展開、檢視,後者應顯清晰的斑點。

3.3.2 (2)分離

用於鑑別時,對照品溶液與供試品溶液中相應的主斑點,應顯示兩個清晰分離的斑點。用於限量檢查和含量測定時,要求定量峯與相鄰峯之間有較好的分離度,分離度(R)的計算公式爲:

R=2(d2-d1)/(W1+W2

式中

d2爲相鄰兩峯中後一峯與原點的距離;

d1爲相鄰兩峯中前一峯與原點的距離;

W1及W2爲相鄰兩峯各自的峯寬。

除另有規定外,分離度應大於1.0。

3.3.3 (3)重複性

同一供試品溶液在同一薄層板上平行點樣的待測成分的峯面積測量值的相對標準偏差應不大於3.0%;需顯色後測定的相對標準偏差應不大於5.0%。

3.4 4.測定法

3.4.1 (1)鑑別

取適宜濃度的對照溶液與供試品溶液,在同一薄層板上點樣、展開與檢視,供試品溶液所顯主斑點的顏色(或熒光)和位置應與對照溶液的斑點一致。

3.4.2 (2)限度檢查

採用定量配製的對照品對照或對照品稀釋對照。供試品溶液色譜中待檢查的斑點應與相應的對照品溶液或系列對照品溶液的相應斑點比較,顏色(或熒光)不得更深;或照薄層色譜掃描法操作,峯面積值不得大於對照品的峯面積值。必要時應規定檢查的斑點數和限量值

3.4.3 (3)含量測定

照薄層色譜掃描法,測定供試品中相應成分的含量。

3.5 5.薄層色譜掃描法

係指用一定波長的光照射在薄層板上,對薄層色譜中可吸收紫外光或可見光的斑點,或經激發後能發射出熒光的斑點進行掃描,將掃描得到的圖譜及積分數據用於鑑別、檢查或含量測定。測定時可根據不同薄層掃描儀的結構特點,按照規定方式掃描測定,一般選擇反射方式,採用吸收法或熒光法。除另有規定外,含量測定應使用市售薄層板。

掃描方法可採用單波長掃描或雙波長掃描。如採用雙波長掃描,應選用待測斑點無吸收或最小吸收的波長爲參比波長,供試品色譜中待測斑點的比移值(Rf值)和光譜掃描得到的吸收光譜圖或測得的光譜最大吸收與最小吸收應與對照品相符,以保證測定結果的準確性。薄層掃描定量測定應保證供試品斑點的量在線性範圍內,必要時可適當調整供試品溶液的點樣量,供試品與對照品同板點樣、展開、掃描、測定和計算。薄層色譜掃描用於含量測定時,通常採用線性迴歸二點法計算,如線性範圍很窄時,可用多點法校正多項式迴歸計算。供試品溶液和對照品溶液應交叉點於同一薄層板上,供試品點樣不得少於2個,對照品每一濃度不得少於2個。掃描時,應沿展開方向掃描,不可橫向掃描。

4 附錄Ⅵ C柱色譜法

4.1 1.吸附柱色譜

色譜柱爲內徑均勻、下端(帶或不帶活塞)縮口的硬質玻璃管,端口或活塞上部鋪墊適量棉花玻璃纖維,管內裝入吸附劑。吸附劑的顆粒應儘可能大小均勻,以保證良好的分離效果。除另有規定外,通常採用直徑爲0.07~0.15 mm的顆粒。色譜柱的大小吸附劑的品種和用量,以及洗脫時的流速,均按各品種項下的規定

4.1.1 (1)吸附劑的填裝

幹法 將吸附劑一次加入色譜柱,振動管壁使其均勻下沉,然後沿管壁緩緩加入洗脫劑;若色譜柱本身不帶活塞,可在色譜柱下端出口處連接活塞,加入適量的洗脫劑,旋開活塞使洗脫劑緩緩滴出,然後自管頂緩緩加入吸附劑,使其均勻地潤溼下沉,在管內形成鬆緊適度的吸附層。操作過程中應保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。

溼法 將吸附劑與洗脫劑混合,攪拌除去空氣泡,徐徐傾入色譜柱中,然後加入洗脫劑將附着在管壁的吸附劑洗下,使色譜柱面平整。

俟填裝吸附劑所用洗脫劑從色譜柱自然流下,至液麪和柱表面相平時,即加供試品溶液

4.1.2 (2)供試品的加入

除另有規定外,將供試品溶於開始洗脫時使用的洗脫劑中,再沿管壁緩緩加入,注意勿使吸附劑翻起。或將供試品溶於適當的溶劑中,與少量吸附劑混勻,再使溶劑揮發去盡使呈鬆散狀,加在已製備好的色譜柱上面。如供試品在常用溶劑中不溶,可將供試品與適量的吸附劑在乳鉢中研磨混勻後加入。

4.1.3 (3)洗脫

除另有規定外,通常按洗脫洗脫能力大小遞增變換洗脫劑的品種和比例,分部收集流出液,至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時,再改變洗脫劑的品種和比例。操作過程中應保持有充分的洗脫劑留在吸附層的上面。

4.2 2.分配柱色譜

方法吸附柱色譜基本一致。裝柱前,先將固定液溶於適當溶劑中,加入適宜載體,混合均勻,待溶劑完全揮幹後分次移入色譜柱中並用帶有平面的玻棒壓緊;供試品可溶於固定液,混以少量載體,加在預製好的色譜柱上端。

洗脫劑需先加固定液混合使之飽和,以避免洗脫過程中固定液的流失。

5 附錄Ⅵ D高效液相色譜法

高效液相色譜法系採用高壓輸液泵規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱,對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品,由流動相帶入柱內,各組分在柱內被分離,並依次進入檢測器,由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。

5.1 1.對儀器的一般要求和色譜條件

所用的儀器爲高效液相色譜儀。儀器應定期檢定並符合有關規定

5.1.1 (1)色譜柱

反相色譜系統使用非極性填充劑,常用的色譜柱填充劑爲化學鍵合硅膠,以十八烷基硅烷鍵合硅膠最爲常用,辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠(如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等)也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑,常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑;分子排阻色譜系統使用凝膠高分子多孔微球等填充劑;對映異構體的分離通常使用手性填充劑。填充劑的性能(如載體形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等)以及色譜柱的填充,直接影響供試品的保留行爲分離效果。分析分子量小於2000的化合物應選擇孔徑在15nm(1nm=10捕獲.JPG)使用微徑柱時,輸液泵性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配;如有必要,色譜條件也需作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時,應以品種項下規定的色譜條件的測定結果爲準。

以硅膠爲載體的鍵合固定相的使用溫度通常不超過40℃,爲改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度,但不宜超過60℃。

流動相的pH值控制在2~8之間。當pH值大於8時,可使載體硅膠溶解;當pH值小於2時,與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH值大於8的流動相時,應選用耐鹼的填充劑,如採用高純硅膠爲載體並具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機一無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等;當需使用pH值小於2的流動相時,應選用耐酸的填充劑,如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機一無機雜化填充劑等。

5.1.2 (2)檢測

最常用的檢測器爲紫外檢測器,包括二極管陣列檢測器,其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器等。

紫外、熒光、電化學檢測器爲選擇性檢測器,其響應值不僅與供試品溶液的濃度有關,還與化合物結構有關;蒸發光散射檢測器和示差折光檢測器爲通用型檢測器,對所有的化合物均有響應;蒸發光散射檢測器對結構類似的化合物,其響應值幾乎僅與供試品的質量有關;二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜,故可用於供試品的光譜鑑定和色譜峯的純度檢查

紫外、熒光、電化學和示差折光檢測器的響應值與供試品溶液的濃度在一定範圍內呈線性關係,但蒸發光散射檢測器的響應值與供試品溶液的濃度通常呈指數關係,故進行計算時,一般需經對數轉換

不同的檢測器,對流動相的要求不同。如採用紫外檢測器,所用流動相應符合紫外-可見分光光度法2010年版藥典一部附錄Ⅴ A)項下對溶劑的要求;採用低波長檢測時,還應考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長,並選用色譜級有機溶劑蒸發光散射檢測器和質譜檢測器通常不允許使用含不揮發性鹽組分的流動相。

5.1.3 (3)流動相

反相色譜系統的流動相首選甲醇-水系統(採用紫外末端波長檢測時,首選乙腈-水系統),如經試用不適合時,再選用其他溶劑系統。應儘可能少用含有緩衝液的流動相,必須使用時,應儘可能選用含較低濃度緩衝液的流動相。由於C18鏈在水相環境中不易保持伸展狀態,故對於十八烷基硅烷鍵合硅膠爲固定相的反相色譜系統,流動相中有機溶劑的比例通常應不低於5%,否則C18鏈的隨機捲曲將導致組分保留值變化,造成色譜系統穩定

品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外,其餘如色譜柱內徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等,均可適當改變,以適應供試品並達到系統適用性試驗的要求。其中,調整流動相組分比例時,以組分比例較低者(小於或等於50%)相對於自身的改變量不超過±30%且相對於總量的改變量不超過±10%爲限,如30%相對改變量數值超過總量的10%時,則改變量以總量的±10%爲限。對於必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種,可在該品種項下注明。

5.2 2.系統適用性試驗

色譜系統的適用性試驗通常包括理論板數、分離度、重複性和拖尾因子等四個參數。其中,分離度和重複性尤爲重要。

按各品種項下要求對色譜系統進行適用性試驗,即用規定的對照品溶液系統適用性試驗溶液規定的色譜系統進行試驗,必要時,可對色譜系統進行適當調整,以符合要求。

5.2.1 (1)色譜柱的理論板數(n)

用於評價色譜柱的分離效能。由於不同物質在同一色譜柱上的色譜行爲不同,採用理論板數作爲衡量柱效能的指標時,應指明測定物質,一般爲待測組分或內標物質的理論板數。

規定的色譜條件下,注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液,記錄色譜圖,量出供試品主成分峯或內標物質峯的保留時間tR(以分鐘或長度計,下同,但應取相同單位)和峯寬(W)或半高峯寬(Wh/2),按n=16(tR/W)2或n=5.54(tR/Wh/22計算色譜柱的理論板數。

5.2.2 (2)分離度(R)

用於評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質之間的分離程度,是衡量色譜系統效能的關鍵指標。可以通過測定待測物質與已知雜質的分離度,也可以通過測定待測組分與某一添加的指標性成分(內標物質或其他難分離物質)的分離度,或將供試品或對照品用適當的方法降解,通過測定待測組分與某一降解產物的分離度,對色譜系統進行評價與控制

無論是定性鑑別還是定量分析,均要求待測峯與其他峯、內標峯或特定的雜質對照峯之間有較好的分離度。除另有規定外,待測組分與相鄰共存物之間的分離度應大於1.5。分離度的計算公式爲:

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式中 tR2爲相鄰兩峯中後一峯的保留時間;tR1爲相鄰兩峯中前一峯的保留時間;W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分別爲此相鄰兩峯的峯寬及

半高峯寬(如圖)。

半高峯寬

當對測定結果有異議時,色譜柱的理論板數(n)和分離度(R)均以峯寬(W)的計算結果爲準。

5.2.3 (3)重複性

用於評價連續進樣中,色譜系統響應值的重複性能。採用外標法時,通常取各品種項下的對照品溶液,連續進樣5次,除另有規定外,其峯面積測量值的相對標準偏差應不大於2.0%;採用內標法時,通常配製相當於80%、100%和120%的對照品溶液,加入規定量的內標溶液,配成3種不同濃度的溶液,分別至少進樣2次,計算平均校正因子。其相對標準偏差應不大於2.0%。

5.2.4 (4)拖尾因子(T)

用於評價色譜峯的對稱性。爲保證分離效果和測量精度,應檢查待測峯的拖尾因子是否符合各品種項下的規定。拖尾因子計算公式爲:

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式中W0.05h爲5%峯高處的峯寬;

d1爲峯頂點至峯前沿之間的距離(如圖)。

除另有規定外,峯高法定量時T應在0.95~1.05之間。峯面積法測定時,若拖尾嚴重,將影響峯面積的準確測量。必要時,應在各品種項下對拖尾因子作出規定

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5.3 3.測定法

5.3.1 (1)內標法

按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和內標物質,分別配成溶液,精密量取各適量,混合配成校正因子測定用的對照溶液。取一定量注入儀器,記錄色譜圖。測量對照品和內標物質的峯面積或峯高,按下式計算校正因子:

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式中 As爲內標物質的峯面積或峯高;AR爲對照品的峯面積或峯高;CS爲內標物質的濃度;

CR爲對照品的濃度。

再取各品種項下含有內標物質的供試品溶液,注入儀器,記錄色譜圖,測量供試品中待測成分和內標物質的峯面積或峯高,按下式計算含量:

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式中Ax爲供試品的峯面積或峯高;cx爲供試品的濃度;

A's爲內標物質的峯面積或峯高;C'S爲內標物質的濃度;

f爲校正因子。

採用內標法,可避免因樣品前處理及進樣體積誤差對測定結果的影響。

5.3.2 (2)外標法

按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品和供試品,配製成溶液,分別精密取一定量,注入儀器,記錄色譜圖,測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峯面積(或峯高),按下式計算含量:

捕獲.JPG

式中各符號意義同上。

由於微量注射器不易精確控制進樣量,當採用外標法測定供試品中成分或雜質含量時,以定量環或自動進樣器進樣爲好。

5.3.3 (3)加校正因子的主成分

自身對照法測定雜質含量時,可採用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時,按各品種項下的規定,精密稱(量)取雜質對照品和待測成分對照品各適量,配製測定雜質校正因子的溶液,進樣,記錄色譜圖,按上述(1)法計算雜質的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下,用於校正雜質的實測峯面積。這些需作校正計算的雜質,通常以主成分爲參照,採用相對保留時間定位,其數值一併載人各品種項下。

測定雜質含量時,按各品種項下規定的雜質限度,將供試品溶液稀釋成與雜質限度相當的溶液作爲對照溶液,進樣,調節檢測靈敏度(以噪聲水平可接受爲限)或進樣量(以柱子不過載爲限),使對照溶液的主成分色譜峯的峯高約達滿量程的10%~25%或其峯面積能準確積分[通常含量低於0.5%的雜質,峯面積的相對標準偏差(RSD)應小於10%;含量在0.5%~2%的雜質,峯面積的RSD應小於5%;含量大於2%的雜質,峯面積的RSD應小於2%]。然後,取供試品溶液和對照品溶液適量,分別進樣,供試品溶液的記錄時間,除另有規定外,應爲主成分色譜峯保留時間的2倍,測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峯面積,分別乘以相應的校正因子後與對照溶液主成分的峯面積比較,依法計算各雜質含量。

5.3.4 (4)不加校正因子的主成分

自身對照法 測定雜質含量時,若沒有雜質對照品,也可採用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述(3)法配製對照溶液並調節檢測靈敏度後,取供試品溶液和對照溶液適量,分別進樣,前者的記錄時間,除另有規定外,應爲主成分色譜峯保留時間的2倍,測量供試品溶液色譜圖上各雜質的峯面積並與對照溶液主成分的峯面積比較,計算雜質含量。

若供試品所含的部分雜質未與溶劑峯完全分離,則按規定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ,再記錄等體積純溶劑的色譜圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質峯的總面積(包括溶劑峯),減去色譜圖Ⅱ上的溶劑面積,即爲總雜質峯的校正面積然後依法計算。

5.3.5 (5)面積歸一化法

按各品種項下的規定,配製供試品溶液,取一定量注入儀器,記錄色譜圖。測量各峯的面積和色譜圖上除溶劑峯以外的總色譜峯面積,計算各峯面積佔總峯面積的百分率。

用於雜質檢查時,由於峯面積歸一化法測定誤差大,因此,通常只用於粗略考察供試品中的雜質含量。除另有規定外,一般不宜用於微量雜質的檢查

6 附錄Ⅵ E氣相色譜法

氣相色譜法系採用氣體爲流動相(載氣)流經裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質或其衍生物氣化後,被載氣帶入色譜柱進行分離,各組分先後進入檢測器,用數據處理系統記錄色譜信號。

6.1 1.對儀器的一般要求

所用的儀器爲氣相色譜儀,由載氣源、進樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數據處理系統等組成。進樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均應根據分析要求適當設定

6.1.1 (1)載氣源

氣相色譜法的流動相爲氣體,稱爲載氣,氦、氮和氫可用作載氣,可由高壓鋼瓶或高純度氣體發生器提供,經過適當的減壓裝置,以一定的流速經過進樣器和色譜柱;根據供試品的性質和檢測器種類選擇載氣,除另有規定外,常用載氣爲氮氣。

6.1.2 (2)進樣部分

進樣方式一般可採用溶液直接進樣、自動進樣或頂空進樣。

溶液直接進樣採用微量注射器、微量進樣閥或有分流裝置的氣化室進樣;採用溶液直接進樣或自動進樣時,進樣口溫度應高於柱溫30~50℃;進樣量一般不超過數微升;柱徑越細,進樣量應越少,採用毛細管柱時,一般應分流以免過載。頂空進樣適用於固體和液體供試品中揮發性組分的分離和測定。將固態或液態的供試品製成供試液後,置於密閉小瓶中,在恆溫控制韻加熱室中加熱至供試品中揮發性組分在液態和氣態達到平衡後,由進樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。

6.1.3 (3)色譜柱

色譜柱爲填充柱或毛細管柱。填充柱的材質爲不鏽鋼或玻璃,內徑爲2~4mm,柱長爲2~4m,內裝吸附劑、高分子多孔小球或塗漬固定液的載體,粒徑爲0.18~0.25mm、0.15~0.18mm或0.125~0.15mm。常用載體爲經酸洗並硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球,常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細管柱的材質爲玻璃石英,內壁或載體經塗漬或交聯固定液,內徑一般爲0.25mm、0.32mm或0.53mm,柱長5~60m,固定液膜厚0.1~5.0μm,常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。

新填充柱和毛細管柱在使用前需老化處理,以除去殘留溶劑及易流失的物質,色譜柱如長期未用,使用前應老化處理,使基線穩定

6.1.4 (4)柱溫箱

由於柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結果的重現性,因此柱溫箱控溫精度應在±1℃,且溫度波動小於每小時0.1℃。溫度控制系統分爲恆溫和程序升溫兩種。

6.1.5 (5)檢測

適合氣相色譜法檢測器有火焰離子檢測器( FID)、熱導檢測器(TCD)、氮磷檢測器(NPD)、火焰光度檢測器(FPD)、電子捕獲檢測器(ECD)、質譜檢測器(MS)等。火焰離子檢測器對碳氫化合物響應良好,適合檢測大多數的藥物;氮磷檢測器對含氮、磷元素化合物靈敏度高;火焰光度檢測器對含磷、硫元素化合物靈敏度高;電子捕獲檢測器適於含鹵素的化合物;質譜檢測器還能給出供試品某個成分相應的結構信息,可用於結構確證。除另有規定外,一般用火焰離子檢測器,用氫氣作爲燃氣,空氣作爲助燃氣。在使用火焰離子檢測器時,檢測器溫度一般應高於柱溫,並不得低於150℃,以免水汽凝結,通常爲250~350℃。

6.1.6 (6)數據處理系統

可分爲記錄儀、積分儀以及計算機工作站等。

品種項下規定的色譜條件,除檢測器種類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外,其餘如色譜柱內徑、長度、載體牌號、粒度、固定液塗布濃度、載氣流速、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等,均可適當改變,以適應具體品種並符合系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於30分鐘內記錄完畢。2.系統適用性試驗

除另有規定外,應照高效液相色譜法2010年版藥典一部附錄Ⅵ D)項下的規定

6.2 3.測定法

(1)內標法

(2)外標法

(3)面積歸一化法

上述(1)~(3)法的具體內容均同高效液相色譜法2010年版藥典一部附錄ⅥD)項下相應的規定

(4)標準溶液加入法 精密稱(量)取某個雜質或待測成分對照品適量,配製成適當濃度的對照品溶液,取一定量,精密加入到供試品溶液中,根據外標法或內標法測定雜質或主成分含量,再扣除加入的對照品溶液含量,即得供試品溶液中某個雜質和主成分含量。

也可按下述公式進行計算,加入對照品溶液前後校正因子應相同,即:

捕獲.JPG

則待測組分的濃度cx可通過如下公式進行計算:

捕獲.JPG

式中 cx爲供試品中組分X的濃度;

Ax爲供試品中組分X的色譜峯面積

△cx爲所加入的已知濃度的待測組分對照品的濃度;Ais爲加入對照品後組分X的色譜峯面積

由於氣相色譜法的進樣量一般僅數微升,爲減小進樣誤差,尤其當採用手工進樣時,由於留針時間和室溫等對進樣量也有影響,故以採用內標法定量爲宜;當採用自動進樣器時,由於進樣重複性的提高,在保證分析誤差的前提下,也可採用外標法定量。當採用頂空進樣時,由於供試品和對照品處於不完全相同的基質中,故可採用標準溶液加入法以消除基質效應的影響;當標準溶液加入法與其他定量方法結果不一致時,應以標準加入法結果爲準。

7 附錄Ⅵ F毛細管電泳

毛細管電泳法是指以彈性石英毛細管爲分離通道,以高壓直流電場爲驅動力,依據供試品中各組分的淌度(單位電場強度下的遷移速度)和(或)分配行爲的差異而實現各組分分離的一種分析方法

熔融石英毛細管內充滿操作緩衝液時,管內壁上硅羥基解離釋放氫離子溶液中使管壁帶負電荷並與溶液形成雙電層(ζ電位),即使在較低pH值緩衝液中情況也如此。當毛細管兩端加上直流電壓時將使帶正電的溶液整體地移向負極端。此種在電場作用溶液的整體移動稱爲電滲流(EOF)。內壁硅羥基的解離度與操作緩衝液pH值和添加的改性劑有關。降低溶液pH值會降低解離度,減小電滲流;增高溶液pH值提高解離度,增加電滲流。有機添加劑的加入有時會抑制內壁硅羥基的解離,減小電滲流。在操作緩衝液中帶電粒子在電場作用下以不同速度向極性相反的方向移動,形成電泳。在操作緩衝液中帶電粒子運動速度等於其電泳速度和電滲速度的矢量和。電滲速度通常大於電泳速度,因此電泳時各組分即使是陰離子也會從毛細管陽極端流向陰極端。爲了減小或消除電滲流,除了降低操作緩衝液pH值之外,還可以採用內壁聚合物塗層的毛細管。這種塗層毛細管可減少大分子在管壁上的吸附

7.1 1.分離模式

毛細管電泳分離模式有以下幾種。

7.1.1 (1)毛細管區帶電泳(CZE)

將待分析溶液引入毛細管進樣一端,施加直流電壓後,各組分按各自的電泳流和電滲流的矢量和流向毛細管出口端,按陽離子、中性粒子和陰離子及其電荷大小的順序通過檢測器。中性組分彼此不能分離。出峯時間稱爲遷移時間(tm),相當於高效液相色譜和氣相色譜中的保留時間。

7.1.2 (2)毛細管凝膠電泳(CGE)

在毛細管中裝入單體和引發劑引發聚合反應生成凝膠,這種方法主要用於分析蛋白質、DNA等生物大分子。另外還可以利用聚合物溶液,如葡聚糖等的篩分作用進行分析,稱爲毛細管無膠篩分。有時將它們統稱爲毛細管篩分電泳,下分爲凝膠電泳和無膠篩分兩類。

7.1.3 (3)毛細管等速電泳(CITP)

採用前導電解質和尾隨電解質,在毛細管中充人前導電解質後,進樣,電極槽中換用尾隨電解質進行電泳分析,帶不同電荷的組分遷移至各個狹窄的區帶,然後依次通過檢測器。

7.1.4 (4)毛細管等電聚焦電泳(CIEF)

將毛細管內壁塗覆聚合物減小電滲流,再將供試品和兩性電解質混合進樣,兩個電極槽中分別加入酸液和鹼液,施加電壓後毛細管中的操作電解質溶液逐漸形成pH梯度,各溶質在毛細管中遷移至各自的等電點(pI)時變爲中性形成聚焦的區帶,而後用壓力或改變檢測器末端電極槽儲液的pH值方法使溶質通過檢測器。

7.1.5 (5)膠束電動毛細管色譜(MEKC或MECC)

當操作緩衝液中加人大於其臨界膠束濃度的離子表面活性劑時,表面活性劑就聚集形成膠束,其親水端朝外、疏水非極性核朝內,溶質則在水和膠束兩相間分配,各溶質因分配係數存在差別而被分離。對於常用的陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉,進樣後極強親水性組分不能進入膠束,隨操作緩衝液流過檢測器(容量因子k’=O);極強疏水性組分則進入膠束的核中不再回到水相,最後到達檢測器(k’=∞)。常用的其他膠束試劑還有陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨膽酸等。

7.1.6 (6)毛細管電色譜(CEC)

將細粒徑固定相填充到毛細管中或在毛細管內壁塗覆固定相以電滲流驅動操作緩衝液(有時再加輔助壓力)進行分離

以上分離模式(1)和(5)使用較多。(5)和(6)兩種模式的分離機理以色譜爲主,但對荷電溶質則兼有電泳作用

操作緩衝液中加入各種添加劑可獲得多種分離效果。如加入環糊精、衍生化糊精、冠醚、血清蛋白、多糖膽酸鹽或某些抗生索等,可拆分手性化合物;加入有機溶劑可改善某些組分的分離效果,以至可在非水溶液中進行分析

7.2 2.對儀器的一般要求

毛細管電泳儀的主要部件及其性能要求如下。

7.2.1 (1)毛細管

用彈性石英毛細管,內徑50μm和75μm兩種使用較多(毛細管電色譜有時用內徑更大些的毛細管)。細內徑分離效果好,且焦耳熱小,允許施加較高電壓;但若採用柱上檢測,則因光程較短,其檢測比較粗內徑管要差。毛細管長度稱爲總長度,根據分離度的要求,可選用20~100cm長度;進樣端至檢測器間的長度稱爲有效長度。毛細管常盤放在管架上控制在一定溫度下操作,以控制焦耳熱,操作緩衝液黏度和電導率,對測定的重複性很重要。

7.2.2 (2)直流高壓電源

採用0~30kV(或相近)可調節直流電源,可供應約300μA電流,具有穩壓和穩流兩種方式可供選擇。

7.2.3 (3)電極和電極槽

兩個電極槽裏放入操作緩衝液,分別插入毛細管的進口端與出口端以及鉑電極;鉑電極連接至直流高壓電源,正負極可切換。多種型號的儀器將試樣瓶同時用作電極槽。

7.2.4 (4)沖洗進樣系統

每次進樣之前毛細管要用不同溶液沖洗,選用自動沖洗進樣儀器較爲方便。進樣方法有壓力(加壓)進樣、負壓(減壓)進樣、虹吸進樣和電動(電遷移)進樣等。進樣時通過控制壓力或電壓及時間來控制進樣量。

7.2.5 (5)檢測系統

紫外-可見分光檢測器、激光誘導熒光檢測器、電化學檢測器和質譜檢測器均可用作毛細管電泳檢測器。其中以紫外-可見分光光度檢測器應用最廣,包括單波長、程序波長和二極管陣列檢測器。將毛細管接近出口端的外層聚合物剝去約2mm一段,使石英管壁裸露,毛細管兩側各放置一個石英聚光球,使光源聚焦在毛細管上,透過毛細管到達光電池。對無光吸收(或熒光)的溶質檢測,還可果用間接測定法,即在操作緩衝液中加入對光有吸收(或熒光)的添加劑,在溶質到達檢測窗口時出現反方向的峯。

7.2.6 (6)數據處理系統

與一般色譜數據處理系統基本相同。3.系統適用性試驗

爲考察所配置的毛細管分析系統設定的參數是否適用,系統適用性的測試項目和方法高效液相色譜法氣相色譜法相同,相關的計算式和要求也相同;如重複性(相對標準偏差,RSD)、容量因子(k’)、毛細管理論板數(n)、分離度(R)、拖尾因子(T)、線性範圍、最低檢測限(LOD)和最低定量限(LOQ)等,可參照測定。具體指標應符合各品種項下的規定,特別是進樣精度和不同荷電溶質遷移速度的差異對分析精密度的影響。

7.3 4.基本操作

(1)按照儀器操作手冊開機,預熱,輸入各項參數,如毛細管溫度、操作電壓、檢測波長和沖洗程序等。操作緩衝液過濾脫氣沖洗液、緩衝液等放置於樣品瓶中,依次放入進樣器。

(2)毛細管處理的好壞,對測定結果影響很大。未塗層新毛細管要用較濃鹼液在較高溫度(例如用1mol/L氫氧化鈉溶液在60℃)沖洗,使毛細管內壁生成硅羥基,再依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、水和操作緩衝液沖洗數分鐘。兩次進樣中間可僅用緩衝液沖洗,但若發現分離性能改變,則開始須用0.1mol/L氫氧化鈉溶液沖洗,甚至要用濃氫氧化鈉溶液升溫沖洗凝膠毛細管、塗層毛細管、填充毛細管的沖洗則應按照所附說明書操作。沖洗時將盛溶液試樣瓶依次置於進樣器,設定順序和時間進行。

(3)操作緩衝液的種類、pH值和濃度,以及添加劑[用以增加溶質溶解度和(或)控制溶質的解離度、手性拆分等]的選定對測定結果的影響也很大,應照各品種項下的規定配製,根據初試的結果調整、優化。

(4)將供試品溶液瓶置於進樣器中,設定操作參數,如進樣壓力(電動進樣電壓)、進樣時間、正極端或負極端進樣、操作電壓或電流、檢測器參數等,開始測試。根據初試的電泳譜圖調整儀器參數和操作緩衝液以獲得優化結果。而後用優化條件正式測試。

(5)測試完畢後用水沖洗毛細管,注意將毛細管兩端浸入水中保存,如果長久不用應將毛細管用氮吹乾,最後關機。

(6)由於進樣方法的限制,目前毛細管電泳精密度比用定量閥進樣的高效液相色譜法要差,故定量測定以採用內標法爲宜。用加壓或減壓法進樣時,供試品溶液黏度會影響進樣體積,應注意保持試樣溶液和對照品溶液黏度一致;用電動法進樣時,被測組分因電歧視現象和溶液離子強度會影響待測組分的遷移量,也要注意其影響。

8 附錄Ⅵ G離子色譜法

離子色譜法系採用高壓輸液泵系統規定洗脫液泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜分析方法。注入的供試品由洗脫液帶入色譜柱內進行分離後,經過抑制器或衍生系統進入檢測器,由積分儀或數據處理系統記錄色譜信號。離子色譜法常用於無機陰離子、無機陽離子有機酸糖醇類、氨基糖類、氨基酸蛋白質、糖蛋白等物質的定性定量分析。它的分離機理主要爲離子交換,即基於離子交換樹脂上可解離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子之間進行的可逆交換;離子色譜法的其他分離機理還有形成離子對、離子排阻等。

8.1 1.對儀器的一般要求

離子色譜儀器中所有與洗脫液或供試品接觸的管道、器件均應使用惰性材料,如聚醚醚酮(PEEK)等。儀器應定期檢定並符合有關規定

8.1.1 (1)色譜柱

離子交換色譜的色譜柱填充劑有兩種,分別是有機聚合物裁體填充劑和無機載體填充劑。

有機聚合物載體填充劑最爲常用,填充劑的載體一般爲苯乙烯-二乙烯基苯共聚物、乙基乙烯基苯-二乙烯基苯共聚物、聚甲基丙烯酸酯或聚乙烯聚合物等有機聚合物。這類載體的表面通過離子鍵附聚了大量具有陰離子交換功能基(如烷基季銨基、烷醇季銨基等)或陽離子交換功能基(如磺酸、羧酸羧酸一膦酸和羧酸-膦酸冠醚等)的乳膠微粒,可分別用於陰離子或陽離子的交換分離。有機聚合物載體填充劑在較寬的酸鹼範圍(pH0~14)內具有較高的穩定性,且有一定的耐有機溶劑腐蝕性。

無機載體填充劑一般以硅膠爲載體。在硅膠表面的硅醇基通過化學鍵合季銨基等陰離子交換功能基或磺酸基、羧酸基等陽離子交換功能基,可分別用於陰離子或陽離子的交換分離。硅膠載體填充劑機械穩定性好、在有機溶劑中不會溶脹或收縮。硅膠載體填充劑在pH2~8的洗脫液中穩定,一般適用於陽離子樣品分離

8.1.2 (2)洗脫

離子色譜對複雜樣品分離主要依賴於色譜柱的填充劑,而洗脫液相對較爲簡單。分離離子常採用稀鹼溶液、碳酸鹽緩衝液等作爲洗脫液;分離離子常採用稀甲烷磺酸溶液等作爲洗脫液。通過增加或減少洗脫中酸溶液的濃度可提高或降低洗脫液的洗脫能力;在洗脫液內加入適當比例的有機改性劑,如甲醇乙腈等可改善色譜峯峯形。製備洗脫液的去離子水應經過純化處理,電導率一般小於0.056μS/cm。使用的洗脫液需經脫氣處理,常採用氦氣在線脫氣方法,也可採用超聲、減壓過濾或冷凍的方式進行離線脫氣。(3)檢測器 電導檢測器是離子色譜常用的檢測器,其他檢測器有紫外檢測器、安培檢測器、蒸發光散射檢測器等。電導檢測器主要用於測定無機陰離子、無機陽離子和部分極性有機物,如羧酸等。離子色譜法中常採用抑制型電導檢測器,即使用抑制器將具有較高電導率的洗脫液在進入檢測器之前中和成具有極低電導率的水或其他較低電導率的溶液,從而顯著提高電導檢測靈敏度

安培檢測器用於分析解離度低,但具有氧化或還原性質的化合物。直流安培檢測器可以測定碘離子(I-)、硫氰酸根離子(SCN-)和各種酚類化合物等。積分安培檢測器和脈衝安培檢測器則常用於測定糖類氨基酸化合物

紫外檢測器適用於在高濃度氯離子等存在下痕量的溴離子(Br-)、亞硝酸離子(NO2-)、硝酸離子(NO3-)以及其他具有強紫外吸收成分的測定。柱後衍生一紫外檢測法常用於分離分析過渡金屬離子和鑭系金屬等。

蒸發光散射、原子吸收原子發射光譜、電感耦合等離子體原子發射光譜、質譜(包括電感耦合等離子體質譜)也可作爲離子色譜的檢測器。離子色譜在與蒸發光散射檢測器或(和)質譜檢測器等聯用時,一般採用帶有抑制器的離子色譜系統

8.2 2.樣品處理

離子色譜法的色譜柱填充劑大多數不兼容有機溶劑,一旦污染後不能用有機溶劑清洗,所以離子色譜法樣品處理的要求較高。對於基質簡單的澄清水溶液一般通過稀釋和0.45μm濾膜過濾後直接進樣分析。對於基質複雜的樣品,可通過微波消解、紫外光降解、固相萃取方法去除干擾物後進樣分析

8.3 3.系統適用性試驗

高效液相色譜法2010年版藥典一部附錄Ⅵ D)項下相應的規定

8.4 4.測定法

(1)內標法

(2)外標法

(3)面積歸一化法

上述(1)~(3)法的具體內容均同高效液相色譜法2010年版藥典一部附錄Ⅵ D)項下相應的規定

(4)標準曲線法 按各品種項下的規定,精密稱(量)取對照品適量配製成貯備溶液。分別量取貯備溶液配製成一系列梯度濃度的對照溶液。量取上述梯度濃度的對照品溶液各適量注入儀器,記錄色譜圖,測量對照品溶液中待測組分的峯面積或峯高。以標準溶液的峯面積或峯高爲縱座標,以標準溶液的濃度爲橫座標,迴歸計算標準曲線,其公式爲:

AR=a·cR+b

式中AR爲對照溶液的峯面積或峯高;

cR爲對照溶液的濃度

a爲標準曲線的斜率;

b爲標準曲線的截距。

再取各品種項下供試品溶液,注入色譜儀,記錄色譜圖,測量供試品溶液中待測成分(或其雜質)的峯面積或峯高。按下式計算其濃度:

捕獲.JPG

式中 As爲供試品溶液的峯面積或峯高;

cs爲供試品溶液的濃度

a、b符號的意義同上。

上述測定法中,以外標法和標準曲線法最爲常用。

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