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血漿18-羥-皮質酮

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1 拼音

xuè jiāng 18-qiǎng -pí zhì tóng

2 英文參考

Plasma 18-hydroxy-corticosterone

Plasma 18-OH-B

3 概述

血漿18-羥-皮質18-羥-皮質酮鹽皮質激素,其分泌功能ACTH腎素血管緊張素系統雙重調節。其生物效應主要為潴鈉排鉀。

4 血漿18-羥-皮質酮的醫學檢查

4.1 檢查名稱

血漿18-羥-皮質酮

4.2 分類

激素類測定 > 腎上腺素測定

4.3 取材

血液

4.4 血漿18-羥-皮質酮的測定原理

本法是標記抗原(Ag·)和非標記抗原(Ag)對特異性抗體(Ab)的競爭抑制反應,其反應為Ag·+Ag+Ab(Ag·Ab)+(AgAb)。當Ag·和Ab的量保持恒定,Ag與Ag·之和大于Ab上的有效結合點的數目,在該條件下,Ag與Ag·間存在著函數關系,亦即隨著Ag濃度增加,Ag-Ab生成量多,而Ag·-Ab的數量則減少,游離的Ag·就增多。因為Ag·對Ab的結合,可因Ag競爭結合而遭抑制。反之,當Ag量少時,Ag-Ab生成量就少,Ag·-Ab量增多,而游離的Ag·減少(圖1)。將結合的抗原抗體復合物(B)與游離抗原(F)分離,分別測定B和F的放射活性,計算出B/F或B/B+F值,可制出B/F或B/B+p對Ag量的關系曲線圖。測定時,需用一系列已知濃度的Ag和一定量Ag·及相應抗體Ab混合,然后測出各標準濃度Ag參加下的Ag·-Ab放射結合率(B/B+F)或(B/F),繪出競爭抑制標準曲線(圖2)。試驗時,在同樣條件下,根據被測Ag的放射性結合率,從標準曲線上查知相應Ag含量。

4.5 試劑

(1)抗原的純化:試驗需用高純度的抗原。通常,蛋白質抗原的純度應達到電泳分析純,電泳后僅顯示單一區帶,并具有足夠或完整的免疫原性。一般先經聚丙烯酰胺電泳鑒定,再用等電聚焦SDS聚丙烯酰胺雙相電泳鑒定為單一區帶,然后用于免疫動物核素標記。

純抗原因其溶液中缺乏其他蛋白質作穩定劑,或因貯存在純離子濃度的緩沖液中,故易形成聚合物,因此在純化抗原時需加注意。若采用聚合物抗原的標記,用于RIA中將會顯著增加非特異性結合,降低測定的靈敏度

(2)抗原的標記方法:標記用的核素有γ射線和β射線兩大類。前者常用131I、125I、51Cr,后者多用3H、32P和14C。選擇放射性核素首先要考慮比放射性,比放射性愈高,參與反應的抗原化學量就愈小,測定方法的靈敏度相對就愈高。核放射性和半衰期要適宜,便于使用和防護。標記后的抗原要保持其免疫原性。標記技術要簡便、經濟。

標記方法有直接標記和間接標記兩大類,以最常用的125I為例分述如下。

①直接標記:將125I直接結合于蛋白質側鏈殘基的酪氨酸上,步驟單一,操作簡便,標記物的比放射性較高,但此法僅能用于標記含酪氨酸的化合物,如所含的酪氨酸殘基為蛋白質的特異性和生物活性所必需,則該活性易因標記而失活。

最常用的直接標記法為氯胺T標記法(簡稱h-T):氯胺T是對甲基苯磺基酰胺的N氯衍生物的鈉鹽,在水溶液中分解形成次氯酸成為一種氧化劑。在偏堿溶液中(pH值7.5)能使帶負電荷的125I離子(Na-125I)氧化成帶正電荷的125I離子,借以取代蛋白質酪氨酸苯環的氫,形成二碘酪氨酸。

125I標記率的高低與抗原(蛋白質或多肽分子中酪氨酸的含量及其在分子中的暴露程度有關。

標記方法的原則是將純化抗原和125I加入小試管底部,繼將配制的氯胺T快速沖入,混勻振蕩1~2min后加入偏重亞硫酸鈉終止反應。再加碘化鉀溶液稀釋,然后在葡聚糖G50柱上分離,分別用井型閃爍計數器測定放射性強度(脈沖數/min、cpm),前部為標記抗原峰,后部為游離125I峰。在標記抗原峰試管中加等量1%白蛋白作為穩定劑即為標記抗原液。

②間接標記:是先將125I標記在載體上,純化后再與蛋白質或肽抗原結合,用N琥珀酰亞胺-3-[4-羥5-(125I)碘苯]丙酸鹽(NSHPP)作為間接標記試劑,該試劑的N琥珀酰亞胺基與多肽游離氨基縮合為結合物,使125I標記的苯基與蛋白質的氨基結合。

本法先以氯胺T使125I接上NSHPP,由于在水溶液中它迅速水解為3-(4-羥苯基)丙酸,故在碘化反應中要盡快減少這種水解作用。這種碘標記物必須從水箱抽提到有機溶液中去,再除去有機溶劑后,使125I-NSHPP與蛋白質結合,制成125I-NSHPP-蛋白質標記物。

本法可標記缺乏酪氨酸殘基的多肽,其最大優點是不損傷蛋白質的活性,能保存標記物高度的酶活性免疫活性,適合于對不穩定的蛋白質標記,缺點是操作復雜,標記率低。

(3)標記抗原的鑒定:為保證放射免疫測定的質量,制備的標記物必需作如下鑒定:

游離放射性碘的含量 用三氯乙酸將所有蛋白質沉淀,分別測定沉淀物和上清液的cpm值。一般要求游離碘占總放射性碘的5%以下。標記抗原貯存過久時,可出現標記物的解離,一旦超過5%則應廢棄。

免疫活性 用小量標記抗原加過量抗體,反應后分離B和F,分別測定其放射性,算出百分結合率,此值應在80%以上,值越大,表示損傷抗原越少。

放射強度 它是指單位重量抗原的放射強度,比放射性越高,測定越敏感。標記抗原的比放射性以125I的標記率或利用率表示。

(4)抗體的制備和鑒定 RIA中所用的抗體應具有高親和力和高特異性,制備高價單相抗血清,最好以標記用的純化抗原免疫動物,制備半抗原的抗血清,需先將半抗原與載體結合,使成免疫原,常用的載體為牛血清白蛋白。

抗血清同樣也要加以嚴格鑒定,包括其靈敏度、親和力和特異性。在固定量標記抗原與不同濃度的抗血清作用的條件下,測定B/F值,制得一條B/F值對不同稀釋度抗血清的曲線圖(圖3),該曲線的直線部分上段的斜率是抗體最大親和力的定性標志,也是靈敏度的標志。斜率越大,RIA靈敏度越高,在許多RIA反應系統中,呈最大靈敏度的抗體濃度為B/F=1。

當采用固定量的抗體(Q0)與不同濃度的抗原作用時,以B/F對B作圖,所得曲線的斜率就是親和常數(Ka)的負數(圖4)。

在RIA反應系統中,測定結構相似的不同物質時,可以鑒定抗體的特異性。

4.6 操作方法

本法分三個步驟,即抗原與抗體反應、B和F分離和放射性測定。

(1)抗原與抗體反應:將標本(非標記抗原)、標記抗原和抗血清順序定量加入小試管內,置室溫(15~30℃)作用24h,使其充分競爭結合。

(2)B、F分離:分離技術多種多樣,常用沉淀法。①第二抗體沉淀法:又稱雙抗體法,在受檢抗原與第一抗體特異性反應后加入相應的第二抗體,使形成的抗原-第一抗體-第二抗體的復合物共沉,一經離心即可使結合標記抗原B與游離抗原F分離。本法是特異性沉淀,分離完全,非特異性結合力低。但第二抗體用量較大,成本較高。此外血清濃度、抗凝劑的有無因素可在一定程度上影響結果。②聚乙二醇PEG)沉淀法:使蛋白質處于等電點狀態,水化層破壞而導致蛋白質沉淀。本法優點是PEG制備方便、價廉、分離快速,缺點是非特異沉淀物較多,分離不完全。③第二抗體-聚乙二醇沉淀法:本法既有PEG法的快速沉淀優點,且保持第二抗體特異性沉淀的作用,又減少第二抗體用量,并降低PEG濃度,使非特異沉淀物減少。④活性炭吸附法:利用活性炭表面活性將小分子的游離部分吸附。如在活性炭表面涂上一層葡聚糖,使它表面具有一定孔徑的網眼,從而允許小分子游離抗原或半抗原逸入而被吸附,而大分子復合物則被排斥在外。在抗原與抗體反應后,加入葡聚糖-活性炭,放置5~10min,使游離抗原吸附在活性炭顆粒上,離心使顆粒沉淀,上清液中含有結合的標記抗原。

(3)放射性強度測定:B和F分離后,即可測定其放射性強度。測量儀器有兩類:液體閃爍計數儀(測β射線)和晶體閃爍計數儀(測γ射線)。計數單位是探測器輸出的電脈沖數,單位為cpm(脈沖數/min)。

每次測定均需作一標準曲線圖,以標準抗原的不同濃度為橫坐標,以測到的相應放射性強度為縱坐標作圖。放射性強度可任選B或F,亦可采用計算值B/B+F、B/F或B/B0。標本應作雙份測定,取其平均值,在標準曲線上查出相應的受檢抗原濃度。

4.7 正常值

放射免疫法:

立位:132~318ng/L

臥位(30min):61~137ng/L

4.8 化驗結果臨床意義

(1)腺瘤原發性醛固酮增多癥的18-OH-B濃度升高較增生型原發性醛固酮明顯。

(2)上午立位4h,明顯降低者為腺瘤型原發性醛固酮增多癥;明顯升高者為增生型原發性醛固酮增多癥。

4.9 附注

(1)標本留取同血清皮質醇。但飲食要控制鈉和鉀,標準飲食為:鈉100mmol/d,鉀60~100mmol/d。

(2)服用某些藥物可影響醛固酮測定結果,如口服避孕藥雌激素類、呋塞米、血管緊張素等藥可使測定結果偏高;服用利舍平、脫氫皮質酮、普萘洛爾甲基多巴及使用肝素等,可使測定結果降低。

(3)限制鈉、鉀的飲食可使測定結果偏高。

4.10 相關疾病

原發性醛固酮增多癥

相關文獻

開放分類:化驗及醫學檢查腎上腺素測定激素類測定
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  • 評論總管
    2019/7/17 22:28:14 | #0
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本頁最后修訂于 2013年2月24日 星期日 15:19:47 (GMT+08:00)
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