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微生物限度檢查法

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1 拼音

wēi shēng wù xiàn dù jiǎn chá fǎ

2 注解

微生物限度檢查法系指非規定滅菌制劑及其原、輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法。包括染菌量及控制菌的檢查。

供試品應隨機抽樣。如遇有異常或可疑樣品,須選取有疑義的樣品。一般抽樣量為檢驗用量(2個以上最小包裝單位)的3倍量。供試品在檢驗前不得開啟,在檢查前及檢查中應防止供試品污染菌受損、致死或繁殖。凡能從藥品、瓶口(外蓋內側及瓶口周圍)外觀看出發霉、變質的藥品,可直接判為不合格,無需再抽樣檢查。

檢查的全部過程均應嚴格遵守無菌操作,嚴防再污染。

除另有規定外,本檢查法中細菌培養溫度為30~35℃,霉菌酵母菌培養溫度為25℃~28℃,控制菌培養溫度為36±1℃ 。

細菌、霉菌(酵母菌)計數和控制菌檢查,均應作對照試驗。

檢驗結果的報告以1g、1ml或10cm<2>為單位。

培養基及其制備方法:

1 、營養瓊脂培養基與營養肉湯培養基

無菌檢查法(附錄ⅩⅢ B)

2 、虎紅瓊脂培養基

5g

虎紅(四氯四碘熒光素

0.0133g

葡萄糖

10g

(或0.133%虎紅溶液10ml)

磷酸二氫鉀(KH2PO4)

1g

瓊脂

15~20g

硫酸鎂(MgSO4.7H2O)

0.5g

1000ml

除葡萄糖、虎紅外,取上述成分,混合,加熱溶化后,濾過,加入葡萄糖、虎紅,分裝,115℃滅菌30分鐘。

3 、酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基(YPD)

10g

瓊脂

15~20g

酵母浸出粉

5g

1000ml

葡萄糖

20g

除葡萄糖外,取上述成分,混合,加熱融化后,濾過,加入葡萄糖,分裝,115℃ 滅菌15分鐘。

4 、膽鹽乳糖培養基(BL)

20g

牛膽

1.3g

乳糖

5g

(或去氧膽酸鈉0.25g)

氯化鈉

5g

100ml

磷酸氫二鉀(K2HPO4)

4.0g

磷酸二氫鉀(KH2PO4)

1.3g

除乳糖、牛膽鹽外,取上述成分,混合,加熱使溶解,調節pH值使滅菌后為7.4±0.2,煮沸,濾清,加入乳糖、牛膽鹽,分裝,115℃滅菌30分鐘。

5 、曙紅美亞甲藍瓊脂培養基(EMB)

營養瓊脂培養基

100ml

2%曙紅溶液

2ml

20%乳糖溶液    5ml

0.5%亞甲藍溶液

1.3~1.6ml

取營養瓊脂培養基,加熱融化后,冷至60℃,按無菌操作加入滅菌的其它叁種溶液,搖勻,傾注平皿。

6 、麥康凱瓊脂培養基(MaCC)

20g

1%中性紅溶液

2.5ml

乳糖

10g

瓊脂

15~20g

牛膽鹽

5g

1000ml

氯化鈉

5g

除乳糖、1%中性紅溶液、牛膽鹽及瓊脂外、取上述成分,混合,加熱使溶解,調節pH值使滅菌后為7.2±0.2,加入瓊脂,加熱融化后,再加入其余各成分,搖勻,分裝,115℃滅菌30分鐘,冷至約60℃,傾注平皿。

7 、叁糖鐵瓊脂培養基(TSI)

20g

硫酸亞鐵

0.2g

牛肉浸出粉

5g

硫代硫酸鈉

0.2g

乳糖

10g

0.2%酚紅溶液

12.5ml

蔗糖

10g

瓊脂

12~15g

葡萄糖

1g

1000ml

氯化鈉

5g

除叁糖、0.2%酚紅溶液、瓊脂外,取上述成分,混合,加熱使溶解,調節pH值使滅菌后為7.3±0.1,加入瓊脂,加熱融化后,濾過,再加入其余成分,搖勻,分裝,115℃滅菌30分鐘,制成高底層(2~3cm)短斜面。

8 、四硫磺酸鈉亮綠增菌液(TTB)

5g

硫代硫酸鈉

30g

牛膽鹽

1g

1000ml

碳酸鈣 10g

取上述成分,混合,微溫使溶解,121℃滅菌20分鐘。

臨用前,取上述培養基,每10ml中加入碘溶液(取碘6g與碘化鉀5g,溶于20ml水中)0.2ml和0.1%亮綠溶液0.1ml ,混勻。

9 、沙門氏、志賀氏菌屬瓊脂培養基(SS)

5g

硫代硫酸鈉

8.5g

牛肉浸出粉

5g    1%中性紅溶液

2.5ml

乳糖

10g    0.1%亮綠溶液

0.33ml

牛膽鹽

8.5g    瓊脂

20g

枸櫞酚鈉

8.5g

1000ml

枸櫞酸鐵銨

1g

除糖、指示劑、瓊脂外,取上述成分混合,加熱使溶解,調節pH值使滅菌后為7.2 ±0.1,濾過,加入瓊脂,加熱融化后,121℃滅菌20分鐘,再加入其余成分,搖勻,冷至約60℃,傾注平皿。

10、膽鹽硫乳瓊脂培養基(DHL)

20g

枸櫞酸鈉

1g

牛肉浸出粉

3g

枸櫞酸鐵銨

1g

乳糖

10g

1%中性紅溶液

3ml

蔗糖

10g

瓊脂

18~20g

去氧膽酸鈉

1g

1000ml

硫代硫酸鈉

2.3g

除糖、1%中性紅溶液及瓊脂外,取上述成分混合,微溫使溶解,調節pH值使滅菌后為7.2±0.1,加入瓊脂,加熱融化后,再加入其余成分,搖勻,冷至約60℃,傾注平皿。

11、十六烷叁甲基溴化銨瓊脂培養基

10g

牛肉浸出粉 3g

氯化鈉

5g

瓊脂

15~20g

十六烷叁甲基溴化銨 0.3g

1000ml

除瓊脂外,取上述成分混合,微溫使溶解,調節pH值使滅菌后為7.5±0.1,加入瓊脂,加熱熔化后,分裝,121℃滅菌20分鐘,冷至約60℃,傾注平皿。

12、亞碲酸鹽肉湯培養基

臨用前,取滅菌的營養肉湯培養基,每100ml中加入新配制的1%亞碲酸鈉(鉀)溶液0.2ml,混勻,即得。

13、卵黃高鹽瓊脂培養基

6g

10%氯化鈉卵黃液 100ml

牛肉浸出粉 1.8g

瓊脂

23g

氯化鈉

30g

650ml

除10%氯化鈉卵黃液外,取上述成分混合,微溫使溶解,調節pH值使滅菌后為7.6±0.1。121℃滅菌20分鐘,待冷至約60℃,以無菌操作加入10%氯化鈉卵黃液,充分搖勻,傾注平皿。

10%氯化鈉卵黃液的制備

取新鮮雞蛋一個,以無菌操作取出卵黃,放入10%滅菌氯化鈉溶液100ml中,充分振搖,即得。

14、甘露醇高鹽瓊脂培養基

10g

1%酚紅溶液

2.5ml

牛肉浸出粉 1g

瓊脂

15~20g

甘露醇

10g

1000ml

氯化鈉

75g

除甘露醇、1%酚紅溶液及瓊脂外,取上述成分混合,微溫使溶解,調節pH值使滅菌后為7.4±0.2,加入瓊脂,加熱融化后,濾過,分裝,115℃滅菌30分鐘,冷至約60℃,傾注平皿。

15、蛋白胨水培養基

胰蛋白胨

10g

水 1000ml

氯化鈉

5g

取上述成分混合,加熱融化,調節pH值使滅菌后為7.3±0.1,分裝于小試管中,121℃滅菌20分鐘。

16、磷酸鹽葡萄糖胨水培養基

7g

葡萄糖 5g

磷酸氫二鉀(K2HPO4) 3.8g

水 1000ml

取上述成分混合,微溫使溶解,調節pH值使滅菌后為7.3±0.1,分裝于小試管中,121℃滅菌15分鐘。

17、枸櫞酸鹽培養基

氯化鈉

5g

枸櫞酸鈉(無水)

2g

硫酸鎂(MgSO4·7H2O)

0.2g

麝香草酚藍指示液 20ml

磷酸氫二鉀(K2HPO4)

0.8g

瓊脂

15~20g

磷酸二氫銨(NH4H2PO4)

1g

1000ml

除溴麝香草酚藍和瓊脂外,取上述成分,混微溫使溶解,調節pH值使滅菌后為6.9±0.1,加入瓊脂,加熱融化,加入指示劑混勻。分裝于小試管中,121℃滅菌15分鐘,置成斜面。

注:所用瓊脂應不含游離糖,用前用水浸泡沖洗

18、糖、醇發酵培養基

基礎液

10g

0.5%酸性復紅指示劑 10ml

糖、醇 0.5%

(或溴麝香草酚藍指示液6ml )

氯化鈉

5g

1000ml

取胨和氯化鈉加入水中,微溫使溶解,調節pH值使滅菌后為7.4,加入指示劑混勻,分裝每瓶100ml,121℃滅菌15分鐘。

配制葡萄糖發酵管時,于100ml基礎液中加入0.5g葡萄糖,分裝于含杜氏管(Durham)的小試管中。121℃滅菌15分鐘,配制其它糖醇發酵管時,將各種糖醇分別配成10%溶液,與基礎液同時于121℃滅菌15分鐘。以無菌操作將5ml糖醇溶液加入100ml基礎液內,分裝于滅菌小試管中。

注:糖醇溶液亦可采用薄膜過濾法除菌。

19、5%乳糖發酵管

0.2g

乳糖

5g

氯化鈉

0.3g

溴麝香草酚藍指示液

0.6ml

磷酸氫二鈉(Na2·HPO4·12H2O)

0.2g

1000ml

除乳糖和指示劑外,取上述成分,混合,微溫使溶解,調節pH值使滅菌后為7.4,加入乳糖及指示劑,混勻,分裝于含杜氏管的滅菌小試管中,115℃滅菌15分鐘。

20、尿素瓊脂培養基

1g

葡萄糖

1g

氯化鈉

5g

20%尿素溶液 1000ml

磷酸二氫鉀(KH2PO4) 2g

瓊脂

20g

0.2%酚紅溶液

6ml

1000ml

除尿素和瓊脂外,取上述成分,混合,調節pH值使滅菌后為7.2±0.1,加入瓊脂,加熱溶化并分裝于錐形瓶,121℃滅菌20分鐘。冷至50~55℃,加入經薄膜過濾除菌的尿素溶液,混勻。尿素的最終濃度為2%,分裝于滅菌試管中,置成斜面。

21、氰化鉀培養基

3g

磷酸氫二鈉(Na2HPO4) 5.64g

氯化鈉

5g

氰化鉀試液

磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.225g

1000ml

除氰化鉀試液外,取上述成分,混合,調節pH值使滅菌后為7.5±0.1,121℃滅菌20分鐘,冷卻后,每100ml培養基中加入氰化鉀試液1.5ml,分裝于12×100mm滅菌試管內,每管4ml,立即用滅菌橡皮塞塞緊,置4℃保存。同時,以不加氰化鉀試液的培養基作為對照培養基,分裝于滅菌試管中。

22、賴氨酸脫羧酶試驗培養基

5g

1.6%溴甲酚乙醇溶液

1ml

酵母浸出粉 3g

L-賴氨酸(DL-賴氨酸) 0.5(1g)/100ml

葡萄糖

1g

1000ml

除賴氨酸外,取上述成分,混合,加熱溶解后分裝,每瓶100ml。加入L-賴氨酸0.5g(DL-賴氨酸1g)調節pH值使滅菌后為6.8,同時以不加賴氨酸培養基作為對照。分裝于滅菌的小試管內,每管1ml并滴加一層液體石蠟,121℃滅菌10分鐘。

23、綠膿菌素(pyocyanin)測定用培養基(PDP瓊脂)

20g

甘油

10ml

氯化鎂(無水) 1.4g

瓊脂

18~20g

硫酸鉀(無水)

10g

1000ml

取胨、氯化鎂和硫酸鉀加入水中,微溫使深解。調節pH值使滅菌后為7.3±0.1,加入甘油及瓊脂,加熱溶解,121℃滅菌20分鐘,置成斜面。

24、明膠培養基

5g

明膠 120g

牛肉浸出粉 3g

水 1000ml

取上述成分加入水中,浸泡約20分鐘,隨時攪拌,加熱使溶解,調節pH值使滅菌后為7.3±0.1,分裝于小試管中,115℃滅菌20分鐘。

25、硝酸鹽胨水培養基

10g

亞硝酸鈉

0.5g

酵母浸出粉 3g

1000ml

硝酸鉀

2g

取胨及酵母浸出粉加入水中,微溫使溶解,調節pH值使滅菌后為7.3±0.1,加入硝酸鉀和亞硝酸鈉溶解,混勻。分裝于含杜氏管的小試管中,115℃滅菌20分鐘。

試藥

牛肉浸出粉 “Lab-lemco”powder

本品為米色粉末在水中溶解。

牛膽鹽 Bile Salt Ox

本品為淡黃色或黃棕色粉末;味苦而甜;具吸濕性。在水和醇中易溶。

沙黃(番紅)Safranine T [C20H19ClN4=350.85]

本品為紅棕色粉末,現紅光;為堿基染料

在水中溶解,在乙醇中易溶。

虎紅(四氯四碘熒光素鈉鹽)Rose bengal

[C20H2Cl4I4Na2O5=1017.6]

本品為棕紅色粉末。

在水中溶解,溶液呈紫色,無熒光;在硫酸中溶解,溶液為棕色。

枸櫞酸鐵銨

Ammonium ferric citrate

[C12H22FeN3)O14=488.16]

本品為棕紅色或綠色鱗片或粉末;易潮解,見光易還原成亞鐵。

在水中溶解,在醇和醚中不溶。

胰蛋白胨 Tryptone

本品為米黃色粉末。在水中溶解。

酚紅 Phenol Red

[C19H14O5S=354.38]

本品為深紅色結晶性粉末。

在乙醇中溶解,在水、叁氯甲烷和醚中不溶。

DL-賴氨酸 DL-Lysine

[C6H14N2O2=146.19]

本品為白色結晶;極易潮解。在水中溶解。

L-賴氨酸 L-Lysine

[C6H14N2O2=146.19]

本品為白色針狀結晶;在空氣中吸收二氧化碳

在水中易溶解,在醇中微溶解,在醚中不溶。

酸性復紅 Fuchsin Acid [C20H17N3Na2O9S3=585.54]

本品為綠色有金屬光澤的顆料或深紅色粉末。

在水中溶解,在醇中不溶。

磷酸二氫銨

Ammonium Phosphate Monobasic [NH4H2PO4=115.03]

本品為無色結晶或白色結晶性粉末。在水中溶解,在乙醇中不溶。

試液

鹽酸二甲基對苯二胺試液

取二鹽酸二甲基對苯二胺0.1g,加水10ml,即得。需新鮮少量配制,于冷處避光保存,如試液變成紅褐色,不可使用。

甲基紅試液

取甲基紅0.1g,加入乙醇300ml,使溶解后,加水至500ml,即得。

無菌對氨基苯甲酸試液

取對氨基苯甲酸0.1g,加入含有10ml水的帶塞試管中,121℃滅菌20分鐘。

亞碲酸鈉(鉀)試液

取亞碲酸鈉(鉀)0.1g,加新鮮煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。

沙黃(番紅)試液

取沙黃(番紅)0.25g,加乙醇10ml,使完全溶解后,加水至100ml。

無菌尿素試液

取尿素20.0g,加水100ml,充分搖勻使溶解,濾過除菌。或在尿素試液中加麝香草酚1.0g ,于室溫放置1~2天,即得。配制時需無菌操作。

亞甲藍試液

取亞甲藍0.5g,加水溶解使成100ml。

虎紅試液

取虎紅0.1g,加水使溶解成75ml。

無菌枸櫞酸鈉-氯化鈉試液

取枸櫞酸鈉0.5g,加0.9%氯化鈉溶液10ml,121℃滅菌20分鐘。

草酸銨試液

取草酸銨1.0g,加水使溶解成100ml。

亮綠試液

取亮綠0.1g,加水100ml使溶解。

結晶紫試液

取結晶紫1.0g,加乙醇20ml使溶解,加1%草酸銨水溶液80ml,混勻。靜置48小時使用,置密閉棕色瓶中儲存。

氫氧化鉀試液

取氫氧化鉀40.0g,加水使溶解成100ml。

鹽酸試液

取鹽酸8.4ml,加水稀釋至100ml。

α-萘酚的乙醇試液

取α-萘酚6.0g,加無水乙醇使溶解成100ml。

氰化鉀試液

取氰化鉀0.5g,加水使溶解成100ml。

氯化叁苯四氮唑試液

取氯化叁苯四氮唑0.1g,加水使溶解10ml。

碘試液

取碘化鉀2.0g,加水3~5ml使溶解,加入碘片1.0g,使全部溶解后,加水稀釋至300ml 。置密閉棕色瓶儲存。

曙紅鈉試液

取曙紅鈉20g,加水使溶解成100ml。

基質試液

取對二甲氨基苯甲醛5.0g,加入戊醇(或丁醇)75ml,充分振搖,使完全溶解后,再取濃鹽酸25ml徐徐滴入,加滴邊振搖,以免驟熱導致溶液色澤變深;或取對二甲氨基苯甲醛1.0g,加入乙醇95ml,充分振搖,使完全溶解后,取鹽酸20ml徐徐滴入。

稀釋劑

0.9%無菌氯化鈉溶液

取氯化鈉9.0g,加水使溶解成1000ml,121℃滅菌20分鐘。

無菌吐溫80-氯化鈉溶液

取吐溫80 1ml,加0.9%氯化鈉溶液使成100ml,121℃滅菌20分鐘。

無菌磷酸鹽緩沖液(pH7.2)

取磷酸氫二鈉25.8g與磷酸二氫鈉4.4g,加水稀釋至 1000ml,121℃滅菌20分鐘。

指示液

中性紅指示液

取中性紅1.0g,細研,加乙醇60ml使溶解,再加水至100ml。

變色范圍

pH6.8~8.0(紅→黃)。

酚紅指示液

取酚紅1.0g,加1mol/L氫氧化鈉2.82ml使溶解,再加水稀釋至100ml。

變色范圍

pH6.8~8.4(黃→紅)。

溴甲酚紫指示液

取溴甲酚紫1.6g,加乙醇使溶解成100ml。

變色范圍

pH5.2~6.8(黃→紫)。

溴麝香草酚藍指示液

取溴麝香草酚藍0.4g,加1mol/L氫氧化鈉溶液0.64ml使溶解,再加水稀釋至100ml。

變色范圍

pH6.0~7.6(黃→藍)。

酸性復紅指示液(Andrade 指示劑)

取酸性復紅0.5g,加水100ml,使溶解,再逐漸加入1mol/L氫氧化鈉溶液16ml,每加1滴均應將溶液充分搖勻后再加第二滴,直至溶液呈草黃色;于沸水內保持15分鐘,再靜置2小時,濾過,即得。

變色范圍

pH 6.0~7.4(黃→紅)。

供試品的檢驗量

每批供試品檢驗量一般為10g 或10ml 。化學藥膜劑為100cm2,貴重的或微量包裝的供試品檢驗量可以酌減,但口服藥品不得少于3g,外用藥品不得少于5g。

供試品均須取自2 個以上的包裝單位,大蜜丸、膜劑除須取自2 個以上包裝單位外,應取自4 丸(片)以上樣品。

供試液的制備

按供試品的理化特性與生物學特性可采取適宜的方法制成供試液。

1 、液體供試品

取供試品10ml,加入90ml稀釋劑中,混勻,作為供試液。油劑可加適量吐溫80;氣霧劑以適宜方法使拋射劑導出后,加入適量稀釋劑,混勻,吸取相當10g或10ml供試品,再稀釋成100ml作供試液;合劑(系指含王漿蜂蜜者,下同)與滴眼劑可用供試品作為供試液。

2 、固體、半固體或粘稠液

供試品稱取供試品10g,置0.9%無菌氯化鈉溶液100ml中,用勻漿儀或其它適宜方法,混勻后,作為供試液。在制備過程中,必要時可加適量吐溫80,并適當加溫,但不應超過45℃。

(1)非水溶性供試品

稱取供試品10g(10ml),加入滅菌吐溫80

30ml、滅菌液體石蠟10ml與0.9%無菌氯化鈉溶60ml(或50ml),同置勻漿儀中,乳化,或其它適發法乳化,作供試液。在制過程中,必要時可適當加溫,但不應超過45℃。

(2)不溶于水的膜劑供試品

取規定量,剪碎,加稀釋劑100ml(必要時可增加稀釋劑),浸泡,振搖,作為供試液。

(3)腸溶膠囊(片)供試品

稱取供試品10g,置含無菌磷酸鹽緩沖液(pH6.8)100ml的錐形瓶內。于45℃水浴中,保溫、振搖、使溶解,作為供試液。

3 含抑菌成分供試品

供試品如干擾控制菌檢驗,按以下方法處理后,依法檢查。

(1) 稀釋法

將供試液種入較大量的培養基中,使該供試液稀釋至不具抑菌作用的濃度。

(2) 離心沉淀集菌法

取規定量的供試液,離心(3000轉)30分鐘,棄去上清液,留底部集菌液約2ml ,再稀釋成原規定量的供試液。如有不溶性藥渣,可先離心(500轉)5分鐘,取全部上層液,再行集菌處理。

(3) 薄膜過濾法

取規定量的供試液,置稀釋劑100ml中,搖勻,以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大于0.45±0.02μm微孔濾膜的薄膜過濾器內,減壓抽干后,用稀釋劑沖洗濾膜3次,每次50~100ml,取出濾膜備檢。

(4) 中和法

凡含磺胺、汞、砷類或防腐劑的供試品,可用相應的試劑鈍化性因子,中和毒性后制成供試液。

對照用菌液

控制菌檢查均應作相應已知菌的對照試驗。對照菌株為大腸桿菌[CMCC(B)44102]、沙門氏菌〔CMCC(B)50094〕、綠膿桿菌〔CMCC(B)10104〕及金黃色葡萄球菌〔CMCC(B) 26003〕。

取相應菌株的營養瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳,接種至營養肉湯培養基內,培養18~20小時后,稀釋至1:10<6>。 對照菌的加入量為50~100 個。

檢查法

1 、細菌、霉菌與酵母菌計數

(1) 平皿菌落計數法

取均勻供試液,進一步稀釋成1:10<2> 、1:10<3>等適宜的稀釋度。分別取連續叁級10倍稀釋的供試液各1ml,置直徑約90mm的平皿中,再注入約45℃的培養基約15ml,混勻,待凝固后,倒置培養,每稀釋度應作2~3個平皿。

細菌計數用營養瓊脂培養基,霉菌計數用虎紅瓊脂培養基,酵母菌計數用酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基,合劑用虎紅瓊脂培養基與酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基。

菌數測定空白對照試驗

取供試驗用的稀釋劑各1ml,置4個無菌平皿中,分別按細菌、霉菌計數用的培養基制備平板、培養、檢查,不得長菌。

細菌培養時間為48小時,分別在24及48小時點計菌落數,一般以48小時菌落數為準。霉菌、酵母培養時間為72小時,分別在48及72小時點計菌落數,一般以72小時菌落數為準。

營養瓊脂平板一般點計細菌菌落數,虎紅瓊脂平板一般點計霉菌菌落數,在特殊情況下,前者同時點計霉菌、酵母菌菌落數,后者同時點計細菌菌落數。酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂平板僅點計酵母菌菌落數。液體制劑同時點計霉菌菌落數及酵母菌菌落數。含蜂蜜及王漿的合劑的霉菌、酵母菌菌落數分別測定,合并計數。菌落如蔓延生長成片,不宜計數。

點計后,計算各稀釋級的平均菌落數,按菌數報告規則報告菌數。

菌數報告規則

細菌宜選取平均菌落數在30~300之間的稀釋級,霉菌宜選取平均菌落數在30~100之間的稀釋級作為報告菌數計算的依據。如有1個稀釋級在30~300(30~100)之間時,將該稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告;如同時有2個稀釋級在30~300(30~100)之間時,按下式計算兩級比值。

    高稀釋級的平均菌落數×稀釋倍數

比值=────────────────

    低稀釋級的平均菌落數×稀釋倍數

當比值≤2時,以兩稀釋級的均值報告,當比值>2時,以低稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告;如同時有3個稀釋級的平均菌落數均在30~300之間時,以后2個稀釋級計算級間比值報告;如各稀釋級的平均菌落數均不在30~300之間,以最接近30或300的稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告;如各稀釋級平均菌落數均在300(100)以上,按最高稀釋級菌落數乘以稀釋倍數報告;如各稀釋級平均菌落數均小于30時,一般按最低稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告。如當1:10(或1:100 )稀釋級平均菌落數等于或大于原液(或1:10稀釋級)時,應以培養基稀釋法測定,按測定結果報告菌數。

(2) 培養基稀釋法

取供試液(原液或1:10供試液)3份,每份各1ml,分別注入5個平皿內(每皿各0.2ml)。每1個平皿傾注營養瓊脂培養基約15ml,混勻,凝固后,倒置培養,計數。每1ml注入的5個平板點計的菌落數之和,即為每1ml的菌落數,共得3組數據。以3份供試液菌落數的平均值乘以稀釋倍數報告。

如各稀釋級平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級平均菌落數小于1時,則報告菌數為小于10個。

2 、控制菌檢查

除另有規定外,取供試液10ml(相當供試品1g、1ml 、10cm<2>),直接或處理后接種,經增菌分離培養后,進行革蘭氏染色生化試驗與血清凝集試驗項檢查。

(1) 大腸桿菌(Escherichia coli)

取膽鹽乳糖培養基3份,每份各100ml,2份分別加入規定量的供試液,其中1份加入對照菌液作陽性對照,第3份加入與供試液等量的稀釋劑作空白對照。培養18~24小時(必要可延至48小時)。空白對照應無菌生長。其余2份培養物劃線接種于曙紅亞甲藍瓊脂平板或麥康凱瓊脂平板,培養18~24小時。當陽性對照的平板呈陽性菌落時,供試品的平板無菌落生長,或有菌落但不同于表1所列的特征,可判為未檢出大腸桿菌。

表 1 大腸桿菌菌落形態特征

───────┬──────────────────
  培養基  │    菌  落  形  態
───────┼──────────────────
曙紅亞甲藍瓊脂│呈紫黑色、淺紫色、藍紫色或粉紅色,
      │菌落中心深紫色或無明顯暗色中心,圓
      │形,稍凸起,邊緣整齊,表面光滑,濕
      │潤,常有金屬光澤。
───────┼──────────────────
 麥康凱瓊脂 │鮮桃紅色或微紅色,菌落中心深桃紅色,
       │圓形,扁平,邊緣整齊,表面光滑,濕潤。
───────┴──────────────────

如生長的菌落與表1所列特征相符或疑似者,應挑選2~3個菌落分別接種于營養瓊脂培養基斜面,培養18小時,作以下檢查:

革蘭氏染色

取上述斜面培養物,涂片,固定。以結晶紫染液染色1分鐘,水洗,革蘭氏碘液媒染1分鐘,水洗,濾紙吸干余水。以乙醇脫色20~30秒鐘,水洗。滴加沙黃染液復染1分鐘,待干后鏡檢。

乳糖發酵試驗

取上述斜面培養物,接種于乳糖發酵管,培養24~48小時,觀察產酸(培養基變色),產氣(杜氏管內有氣泡)。

靛基質試驗

取上述斜面培養物,接種于蛋白胨水培養基中,培養48±2小時,沿管壁加入對靛基質試液0.3~0.5ml,液面呈玫瑰紅色為陽性,呈試劑本色為陰性

甲基紅試驗

取上述斜面培養物,接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養基中,培養48±2小時,于每1ml培養液中加入甲基紅指示劑1滴,立即觀察,呈鮮紅色或桔紅色為陽性,呈黃色為陰性。

乙酰甲基甲醇生成試驗(V-P 試驗)

取上述斜面培養物,接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養基,培養48±2小時,于每2ml培養液中加入α-萘酚乙醇液1ml,混勻,再加40%氫氧化鉀溶液0.4ml,充分振搖,出現紅色為陽性。加試劑4小時內,如出現紅色亦應判為陽性,無紅色反應為陰性。

枸櫞酸鹽利用試驗

取上述斜面培養物,接種于枸櫞酸鹽培養基的斜面上,培養48±2小時,培養基斜面有菌苔生長,培養基由綠色變為藍色時為陽性,培養基顏色無改變時為陰性。

當空白對照試驗呈陰性,供試品檢查為革蘭氏陰性無芽孢桿菌;乳糖發酵產酸產氣或產酸不產氣;IMViC 試驗為陽性、陽性、陰性、陰性或陰性、陽性、陰性、陰性,判為檢出大腸桿菌。對可疑反應的菌株,應重新分離培養后,再作生化試驗證實。

(2) 沙門氏菌(Salmonella species)

取營養肉湯培養基3份,每份各100ml,2份分別加入規定量的供試液,其中1份加入對照菌液作陽性對照,第3份加入與供試液等量的稀釋劑作空白對照。培養18~24小時,空白對照應無菌生長。取其余2份培養液各1ml,分別接種于四硫磺酸鈉亮綠培養基10ml中,培養18~24小時。分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂(或沙門氏、志賀氏菌屬瓊脂)培養基和麥康凱瓊脂(或曙紅亞甲藍瓊脂)培養基的平板上,培養18~24小時或延至40~48小時。當陽性對照的平板呈現陽性菌落時,供試品的平板無菌落生長,或有菌落但不同于表2所列特征時,可判為未檢出沙門氏菌。

如供試品平板生長的菌落特征有與表2所列菌落形態特征相符或疑似者,均應挑選2~3個菌落分別接種于叁糖鐵瓊脂培養斜面上,陽性對照同時接種,培養18~24小時后,陽性對照的斜面應為紅色,底層為黃色,硫化氫陽性,而供試品疑似菌斜面未見紅色、底層未見黃色,可判為未檢出沙門氏菌。否則,應繼續做革蘭氏染色、生化試驗、動力檢查與血清凝集試驗。

表2 沙門氏菌菌落形態特征

 

───────┬────────────────────────────
  培養基  │         菌  落  形  態
───────┼────────────────────────────
膽鹽硫乳瓊脂 │無色至淺橙色,半透明,菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色。
───────┼────────────────────────────
沙門氏、志賀 │無色至淡紅色,半透明或不透明,菌落中心有時帶黑褐色。氏菌屬瓊脂
───────┼────────────────────────────
曙紅亞甲藍瓊脂│無色至淺橙色,透明或半透明,光滑濕潤的圓形菌落。
───────┼────────────────────────────
麥康凱瓊脂  │無色至淺橙色,透明或半透明,菌落中心有時為暗色。
───────┴────────────────────────────

  革蘭氏染色

照大腸桿菌項下方法操作,鏡檢。

靛基質試驗

照大腸桿菌項下操作并判斷結果。

尿素酶試驗

取疑似菌斜面培養物接種于尿素瓊脂培養基斜面上,培養24小時,斜面變為紅色為陽性,不變色為陰性。

氰化鉀試驗

取培養20~24小時的疑似菌株營養肉湯培養液,分別用白金耳沾取1環,接種至對照培養基及氰化鉀培養基內,立即以橡膠塞塞緊,培養24~48小時,對照管應有菌生長,試驗管有菌生長者為陽性,無菌生長為陰性。

賴氨酸脫羧酶試驗

取疑似菌斜面培養物分別接種賴氨酸脫羧酶培養基及對照培養基上。培養24~48小時,對照管應為黃色,試驗管呈紫色為陽性,呈黃色為陰性。

動力檢查

取疑似菌斜面培養物穿刺接種于半固體營養瓊脂培養基管中,培養24小時,細菌沿穿刺線外周擴散生長,為動力陽性,否則為陰性。陰性培養物,應在室溫保留2~3天后,再判斷。

血清凝集試驗

在潔凈載玻片一端,以白金耳沾取沙門氏菌屬A~F“0” 多價血清2~3環,再取斜面上部的培養物少許,與血清混合,將玻片前后側動,如出現凝集現象,應以0.9%氯化鈉溶液與同株培養物作對照試驗,無凝集現象時判為血清凝集陽性。時有反應遲緩,需將玻片與濕棉球置平皿內,約過20分鐘,再觀察。仍未出現凝集時,應取斜面培養物,置含少量0.9%氯化鈉溶液的試管中,制成濃菌懸液,在100℃水浴中保溫30分鐘,待冷,再作凝集試驗。如出現凝集,應判為陽性,否則為陰性。

上述各項試驗反應,一般應為硫化氫陽性(或陰性),靛基質陰性,尿素酶陰性,氰化鉀陰性,賴氨酸脫羧酶陽性,動力檢查陽性,A~F“0” 多價血清凝集試驗陽性。各鑒定結果按表3判定。

表3 沙門氏菌檢查結果判定

──┬─────────────────┬────┬─────────
 序│        血清凝集試驗    │    │
  │       (A~F“0” 血清)   │    │
  ├──┬───────┬──────┤生化試驗│  結  果
  │凝集│ 100℃30分鐘 │0.9%氯化鈉 │    │
 號│反應│  凝集反應 │溶液對照  │    │
──┼──┼───────┼──────┼────┼─────────
 1 │陽性│  陽  性  │ 陰  性 │ 符 合│檢出沙門氏菌
 2 │陰性│  陽  性  │ 陰  性 │ 符 合│檢出沙門氏菌
 3 │陰性│  陰  性  │      │ 不符合│未檢出沙門氏菌
──┴──┴───────┴──────┴────┴─────────

  上述各項試驗任何一項不符合或有可疑反應的培養物,均應進一步鑒定后作出結論。

(3) 綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)

取膽鹽乳糖培養基3份,每份各100ml,2份分別加入規定量的供試液,其中1份加入對照菌液作為陽性對照,第3份加入與供試液等量的稀釋劑作空白對照。培養18~24小時,空白對照應無菌生長,其余2份培養液劃線接種于十六烷叁甲基溴化銨瓊脂培養基平板上,培養18~24小時。當陽性對照的平板呈現陽性菌落時,供試品的平板無菌落或無疑似菌落生長,可判為未檢出綠膿桿菌。

綠膿桿菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散,表面濕潤,灰白色,周圍時有藍綠色素擴散。如生長菌落具有上述特征或疑似者,應挑選2~3個菌落,分別接種營養瓊脂培養基斜面上,培養18~24小時,取培養物革蘭氏染色,并作氧化酶試驗。

氧化酶試驗

取潔凈濾紙片置于平皿內,用無菌玻璃棒取營養瓊脂培養基斜面培養物涂于濾紙片上,再滴加新配制的1%二甲基對苯二胺鹽酸鹽試液,在30秒內呈粉紅色逐漸變為紫紅色為氧化酶試驗陽性。否則為陰性。

如證實為非革蘭氏陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性,均可判為未檢出綠膿桿菌。否則,應進行綠膿菌素試驗。

綠膿菌素(Pyocyanin) 試驗

取上述瓊脂斜面培養物,接種于綠膿菌素測定用培養基斜面上,培養24小時后,在試管內加氯仿3~5ml,攪碎培養基并充分振搖。靜置片刻,將氯仿移至另一試管中,加入1mol/L鹽酸溶液約1ml,振搖后,靜置片刻,如在鹽酸溶液層內出現粉紅色,即為綠膿菌素陽性。試驗同時應有空白對照試驗。

當空白對照試驗呈陰性時,供試品檢查為革蘭氏陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素陽性、可判定為檢出綠膿桿菌。

綠膿菌素陰性的培養物,應繼續以下試驗。

硝酸鹽還原產氣試驗

取營養瓊脂培養基斜面培養物,接種于硝酸鹽胨水培養基中,培養24小時,如在培養基的杜氏管中有氣體產生,即為陽性。

42℃生長試驗 營養瓊脂培養基斜面培養物于0.9%無菌氯化鈉溶液中,制成菌懸液,再將菌懸液接種于營養瓊脂培養基斜面上,立即置41±1℃水浴中培養24~48小時,有菌苔生長者為陽性;否則為陰性。

明膠液化試驗

以接種針沾取營養瓊脂培養基斜面培養物,穿刺于明膠培養基內,培養24小時,取出置冰箱內10~30分鐘。如培養基仍呈溶液狀,為陽性。

當革蘭氏陰性桿菌,氧化酶試驗陽性,綠膿菌素試驗為陰性,其硝酸鹽還原產氣試驗、42℃生長試驗及明膠液化試驗均為陽性時,應判為檢查綠膿桿菌。

(4) 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)

取亞碲酸鈉肉湯(或營養肉湯)培養基3份,每份各100ml,2份分別加入規定量的供試液,其中1份加入對照菌液作為陽性對照,第3份加入與供試液等量的稀釋劑作為空白對照。均培養18~24小時(必要時可延至48小時)。空白對照應無菌生長。取其余2份培養液劃線接種于卵黃高鹽瓊脂培養基平板上或甘露醇高鹽瓊脂培養基平板上,培養24~72小時。當陽性對照的平板呈現陽性菌落時,供試品的平板如無菌落生長,或有菌落但不同于表4所列特征,可判為未檢出金黃色葡萄球菌。

表4 金黃色葡萄球菌菌落形態特征

  ─────┬─────────────────
  培養基 │   菌  落  形  態
 ─────┼─────────────────
  卵黃高鹽 │金黃色、圓形凸起,邊緣整齊,外圍有瓊脂
         │卵磷脂分解的乳濁圈,菌落直徑1~2mm
  ─────┼─────────────────
  甘露醇高鹽│金黃色,圓形凸起,邊緣整齊,外圍有瓊脂
         │黃色環,菌落直徑約0.7~1mm
 ─────┴─────────────────

如有菌落生長并與表4所列特征相符或疑似時,應挑選2~3個菌落,分別接種于營養瓊脂培養基斜面上,培養18~24小時,取其培養物革蘭氏染色,并作血漿凝固酶試驗。

血漿凝固酶試驗

取滅菌小試管3支,各加入血漿①-無菌水(1:1)0.5ml,1支加入被檢菌株的營養肉湯培養液(或濃菌懸液)0.5ml,其余2支作對照管;1支加入金黃色葡萄球菌的營養肉湯培養液或菌懸液0.5ml作陽性對照;另1支加入營養肉湯或0.9%氯化鈉溶0.5ml作空白對照。將3管同時培養。3小時后開始檢查,以后適當時間逐次觀察直至24小時。空白對照管的血漿流動自如,陽性對照管血漿凝固,試驗管血漿凝固者為陽性;陽性對照管和空白對照管任何一管不符合要求時,應另制備血漿,重新試驗。

當空白對照和陽性對照符合要求,供試品的菌株為革蘭氏陽性球菌、血漿凝固酶試驗陽性,判定為檢出金黃色葡萄球菌。

結果判斷

細菌菌落數、霉菌(酵母菌)菌落數、控制菌叁項均符合該品種微生物限度項下規定,應判供試品合格;其中任何一項不符合該品種項下規定,應判供試品不合格。

細菌菌落數、霉菌(酵母菌)菌落數第一次測定超過該品種項下微生物限度規定時,應從同一批號樣品中隨機抽樣,復試兩次,以叁次結果平均值報告。

眼科用藥的霉菌和酵母菌菌落數復試報告,須以二次復試結果均不得長菌,方可判為供試品合格。

如發現營養瓊脂培養基平板生長霉菌(酵母菌)菌落數或虎紅瓊脂培養基平板上生長細菌菌落數超過該品種項下微生物限度規定時,應判為供試品不合格。

各類制劑檢出控制菌或其他致病菌時,按一次檢出結果為準,不再抽樣復試,即應判該供試品不合格。

血漿的制備

以無菌注射器吸取滅菌的含5%枸櫞酸鈉的0.9%氯化鈉溶液1ml,用無菌操作采取家兔(或羊、人)血9ml,輕輕混勻數分鐘。待血液不凝固時,徐徐放入滅菌離心管中,離心,分離血漿,用滅菌吸管取血漿移至滅菌試管中,置冰箱內備用。臨用前必須用已知血漿凝固酶試驗陽性的金黃色葡萄球菌測試,證明血漿合格后,方可用于試驗。

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    2019/9/17 10:36:54 | #0
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