siRNA

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    目錄
    1. 拼音
    2. 概述
    3. siRNA原理
    4. siRNA的特點
    5. siRNA制備方法
      1. 體外制備
      2. 體內表達

    拼音

    siRNA

    概述

    Small interfering RNA (siRNA):是一種小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAase Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)加工而成。雙鏈RNA經酶切后會形成很多小片段,稱為siRNA。SiRNA是siRISC的主要成員,激發與之互補的目標mRNA的沉默。

    siRNA原理

    RNA干涉(RNAi)在實驗室中是一種強大的實驗工具,利用具有同源性的雙鏈RNA(dsRNA)誘導序列特異的目標基因的沉寂,迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用,是對特定信使RNA(mRNA)進行降解的指導要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產物,是RNAi發揮效應所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1調控完成。由于RNA 病毒入侵、轉座子轉錄、基因組中反向重復序列轉錄等原因,細胞中出現了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)編碼蛋白質識別外源dsRNA,當dsRNA達到一定量的時候,Rde-1引導dsRNA與Rde-1編碼的Dicer(Dicer是一種RNaseIII 活性核酸內切酶,具有四個結構域:Argonaute家族的PAZ結構域,III型RNA酶活性區域,dsRNA結合區域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區)結合,形成酶-dsRNA復合體。在Dicer酶的作用下,細胞中的單鏈靶mRNA(與dsRNA具有同源序列)與dsRNA的正義鏈互換,原來dsRNA中的正義鏈被mRNA代替而從酶-dsRNA復合物中釋放出來,然后,在ATP的參與下,細胞中存在的一種RNA誘導的沉默復合體RNA-induced silencing complex (RISC,由核酸內切酶、核酸外切酶、解旋酶等構成,作用是對靶mRNA進行識別和切割)利用結合在其上的核酸內切酶的活性來切割dsRNA上處于原來正義鏈位置的靶mRNA分子中與dsRNA反義鏈互補的區域,形成21-23nt的dsRNA小片段,這些小片段即為siRNA。RNAi干涉的關鍵步驟是組裝RISC和合成介導特異性反應的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中,然后與靶標基因編碼區或UTR區完全配對,降解靶標基因,因此說siRNA只降解與其序列互補配對的mRNA。其調控的機制是通過互補配對而沉默相應靶位基因的表達,所以是一種典型的負調控機制。siRNA識別靶序列是有高度特異性的,因為降解首先在相對于siRNA來說的中央位置發生,所以這些中央的堿基位點就顯得極為重要,一旦發生錯配就會嚴重抑制RNAi的效應。

    siRNA的特點

    1. 長度約在22nt左右。

    2. 依賴Dicer酶的加工,是Dicer的產物,所以具有Dicer產物的特點。

    3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。

    4. 是RISC組分。

    5. siRNA合成是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。

    6. siRNA是人工體外合成的,通過轉染進入人體內,是RNA干涉的中間產物。

    7. 結構上, siRNA是雙鏈RNA。

    8. 在Dicer酶的加工過程中, siRNA對稱地來源于雙鏈RNA的前體的兩側臂。

    9. 在作用位置上, siRNA可作用于mRNA的任何部位。

    10. 在作用方式上, siRNA只能導致靶標基因的降解,即為轉錄水平后調控。

    11. siRNA不參與生物生長,是RNAi的產物,原始作用是抑制轉座子活性和病毒感染

    siRNA制備方法

    體外制備

    化學合成

    許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高,定制周期長,特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高,為一個基因合成3―4對siRNAs 的成本就更高了,比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。

    最適用于:已經找到最有效的siRNA的情況下,需要大量siRNA進行研究

    不適用于:篩選siRNA等長時間的研究,主要原因是價格因素

    體外轉錄

    DNA Oligo為模版,通過體外轉錄合成siRNAs,成本相對化學合成法而言比較低,而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規模受到限制,雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs,但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比,還是需要占用研究人員相當的時間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小,穩定性好,效率高,只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果,從而使轉染效率更高。

    最適用于:篩選siRNAs,特別是需要制備多種siRNAs,化學合成的價格成為障礙時。

    不適用于:實驗需要大量的,一個特定的siRNA。長期研究。

    用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA

    其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法――制備一份混合有各種 siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200―1000堿基的靶mRNA模版,用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化,得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后,這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞,方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs,通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

    dsRNA消化法的主要優點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟,為研究人員節省時間和金錢(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜)。不過這種方法的缺點也很明顯,就是有可能引發非特異的基因沉默,特別是同源或者是密切相關的基因。現在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響。

    最適用于:快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型。

    不適用于:長時間的研究項目,或者是需要一個特定的siRNA進行研究,特別是基因治療

    體內表達

    前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs,并且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于:從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。

    siRNA表達載體

    多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種,操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA,而且它是通過添加一串(3到6個)U來終止轉錄的。要使用這類載體,需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈,退火克隆 到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆,這個過程需要幾周甚至數月的時間,同時也需要經過測序以保證克隆 的序列是正確的。

    siRNA表達載體的優點在于可以進行較長期研究――帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久。

    病毒載體也可用于siRNA表達,其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究,避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩定。

    最適用于:已知一個有效的siRNA序列,需要維持較長時間的基因沉默。

    不適用于:篩選siRNA序列(其實主要是指需要多個克隆 和測序等較為費時、繁瑣的工作)。

    siRNA表達框架

    siRNA表達框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版,包括一個RNA pol III啟動子,一段發夾結構siRNA,一個RNA pol III終止位點,能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是,SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟,可以直接由PCR得到,不用一天的時間。因此,SECs成為篩選siRNA的最有效工具,甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點,那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長效抑制的研究。

    這個方法的主要缺點是

    ①PCR產物很難轉染到細胞中(晶賽公司的Protocol可以解決這一問題)

    ②不能進行序列測定,PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發現導致結果不理想

    最適用于:篩選siRNA序列,在克隆到載體前篩選最佳啟動子。

    不適用于:長期抑制研究。(如果克隆到載體后就可以了)

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    詞條siRNAbanlang創建
    參與評價: ()

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    參與討論
    • 評論總管
      2014-9-15 23:11:42 | #0
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