siRNA

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    1 拼音

    siRNA

    2 概述

    Small interfering RNA (siRNA):是一種小RNA分子(~21-25核苷酸),由Dicer(RNAase Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶)加工而成。雙鏈RNA經酶切后會形成很多小片段,稱為siRNA。SiRNA是siRISC的主要成員,激發與之互補的目標mRNA的沉默。

    3 siRNA原理

    RNA干涉(RNAi)在實驗室中是一種強大的實驗工具,利用具有同源性的雙鏈RNA(dsRNA)誘導序列特異的目標基因的沉寂,迅速阻斷基因活性。siRNA在RNA沉寂通道中起中心作用,是對特定信使RNA(mRNA)進行降解的指導要素。siRNA是RNAi途徑中的中間產物,是RNAi發揮效應所必需的因子。siRNA的形成主要由Dicer和Rde-1調控完成。由于RNA 病毒入侵、轉座子轉錄、基因組中反向重復序列轉錄等原因,細胞中出現了dsRNA,Rde-1(RNAi缺陷基因-1)編碼蛋白質識別外源dsRNA,當dsRNA達到一定量的時候,Rde-1引導dsRNA與Rde-1編碼的Dicer(Dicer是一種RNaseIII 活性核酸內切酶,具有四個結構域:Argonaute家族的PAZ結構域,III型RNA酶活性區域,dsRNA結合區域以及DEAH/DEXHRNA解旋酶活性區)結合,形成酶-dsRNA復合體。在Dicer酶的作用下,細胞中的單鏈靶mRNA(與dsRNA具有同源序列)與dsRNA的正義鏈互換,原來dsRNA中的正義鏈被mRNA代替而從酶-dsRNA復合物中釋放出來,然后,在ATP的參與下,細胞中存在的一種RNA誘導的沉默復合體RNA-induced silencing complex (RISC,由核酸內切酶、核酸外切酶、解旋酶等構成,作用是對靶mRNA進行識別和切割)利用結合在其上的核酸內切酶的活性來切割dsRNA上處于原來正義鏈位置的靶mRNA分子中與dsRNA反義鏈互補的區域,形成21-23nt的dsRNA小片段,這些小片段即為siRNA。RNAi干涉的關鍵步驟是組裝RISC和合成介導特異性反應的siRNA蛋白。siRNA并入RISC中,然后與靶標基因編碼區或UTR區完全配對,降解靶標基因,因此說siRNA只降解與其序列互補配對的mRNA。其調控的機制是通過互補配對而沉默相應靶位基因的表達,所以是一種典型的負調控機制。siRNA識別靶序列是有高度特異性的,因為降解首先在相對于siRNA來說的中央位置發生,所以這些中央的堿基位點就顯得極為重要,一旦發生錯配就會嚴重抑制RNAi的效應。

    4 siRNA的特點

    1. 長度約在22nt左右。

    2. 依賴Dicer酶的加工,是Dicer的產物,所以具有Dicer產物的特點。

    3. 生成需要Argonaute家族蛋白存在。

    4. 是RISC組分。

    5. siRNA合成是由雙鏈的RNA或RNA前體形成的。

    6. siRNA是人工體外合成的,通過轉染進入人體內,是RNA干涉的中間產物。

    7. 結構上, siRNA是雙鏈RNA。

    8. 在Dicer酶的加工過程中, siRNA對稱地來源于雙鏈RNA的前體的兩側臂。

    9. 在作用位置上, siRNA可作用于mRNA的任何部位。

    10. 在作用方式上, siRNA只能導致靶標基因的降解,即為轉錄水平后調控。

    11. siRNA不參與生物生長,是RNAi的產物,原始作用是抑制轉座子活性和病毒感染

    5 siRNA制備方法

    5.1 體外制備

    化學合成

    許多國外公司都可以根據用戶要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高,定制周期長,特別是有特殊需求的。由于價格比其他方法高,為一個基因合成3―4對siRNAs 的成本就更高了,比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。

    最適用于:已經找到最有效的siRNA的情況下,需要大量siRNA進行研究

    不適用于:篩選siRNA等長時間的研究,主要原因是價格因素

    體外轉錄

    以DNA Oligo為模版,通過體外轉錄合成siRNAs,成本相對化學合成法而言比較低,而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規模受到限制,雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs,但是反應規模和量始終有一定的限制。而且和化學合成相比,還是需要占用研究人員相當的時間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小,穩定性好,效率高,只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果,從而使轉染效率更高。

    最適用于:篩選siRNAs,特別是需要制備多種siRNAs,化學合成的價格成為障礙時。

    不適用于:實驗需要大量的,一個特定的siRNA。長期研究。

    用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA

    其他制備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法――制備一份混合有各種 siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200―1000堿基的靶mRNA模版,用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ,然后用RNase III (or Dicer) 在體外消化,得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA后,這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞,方法和單一的siRNA轉染一樣。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs,通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

    dsRNA消化法的主要優點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟,為研究人員節省時間和金錢(注意:通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜)。不過這種方法的缺點也很明顯,就是有可能引發非特異的基因沉默,特別是同源或者是密切相關的基因。現在多數的研究顯示這種情況通常不會造成影響。

    最適用于:快速而經濟地研究某個基因功能缺失的表型。

    不適用于:長時間的研究項目,或者是需要一個特定的siRNA進行研究,特別是基因治療

    5.2 體內表達

    前面的3種方法主要都是體外制備siRNAs,并且需要專門的RNA轉染試劑將siRNAs轉到細胞內。而采用siRNA表達載體和基于PCR的表達框架則屬于:從轉染到細胞的DNA模版中在體內轉錄得到siRNAs。這兩種方法的優點在于不需要直接操作RNA。

    siRNA表達載體

    多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種,操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol III啟動子是由于它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA,而且它是通過添加一串(3到6個)U來終止轉錄的。要使用這類載體,需要訂購2段編碼短發夾RNA序列的DNA單鏈,退火克隆 到相應載體的pol III 啟動子下游。由于涉及到克隆,這個過程需要幾周甚至數月的時間,同時也需要經過測序以保證克隆 的序列是正確的。

    siRNA表達載體的優點在于可以進行較長期研究――帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久。

    病毒載體也可用于siRNA表達,其優勢在于可以直接高效率感染細胞進行基因沉默的研究,避免由于質粒轉染效率低而帶來的種種不便,而且轉染效果更加穩定。

    最適用于:已知一個有效的siRNA序列,需要維持較長時間的基因沉默。

    不適用于:篩選siRNA序列(其實主要是指需要多個克隆 和測序等較為費時、繁瑣的工作)。

    siRNA表達框架

    siRNA表達框架(siRNA expression cassettes,SECs)是一種由PCR得到的siRNA表達模版,包括一個RNA pol III啟動子,一段發夾結構siRNA,一個RNA pol III終止位點,能夠直接導入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是,SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟,可以直接由PCR得到,不用一天的時間。因此,SECs成為篩選siRNA的最有效工具,甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端添加酶切位點,那么通過SECs篩選出的最有效的siRNA后,可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用于穩定表達siRNA和長效抑制的研究。

    這個方法的主要缺點是

    ①PCR產物很難轉染到細胞中(晶賽公司的Protocol可以解決這一問題)

    ②不能進行序列測定,PCR和DNA合成時可能差生的誤讀不能被發現導致結果不理想

    最適用于:篩選siRNA序列,在克隆到載體前篩選最佳啟動子。

    不適用于:長期抑制研究。(如果克隆到載體后就可以了)

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    詞條siRNAbanlang創建
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    • 評論總管
      2014-10-24 21:41:41 | #0
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