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石蠟切片

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1 拼音

shí là qiē piàn

2 英文參考

paraffin section

3 器材

切片刀,切片機,恒溫箱,溫臺,熔蠟爐,蠟杯,酒精燈,蠟鏟,展片臺,解剖刀,解剖針,解剖剪,解剖盤,培養皿,吸管,鑷子,單面刀片,臺木,毛筆,灑精燈,包埋紙盒,染色缸,蓋玻片,載玻片,玻片盤,樹膠,樹膠瓶,顯微鏡溫度計,臉盆,水浴鍋。

4 試劑

卡諾氏固定液、FAA固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟蜂蠟、埃利希蘇木精染液, 1%伊紅酒精溶液,1%鹽酸酒精溶液,甘油蛋白粘片劑,郝普特氏粘片劑,中性樹膠。1%番紅,1%固綠,1%過碘酸,Schiff試劑,0.5%偏重亞硫酸鈉溶液,醋酸酐-吡啶混合液,0.5%~1%淀粉糖化酶溶液。

5 材料

鼠肝、腎、心肌骨骼肌或其他組織大豆小麥綠豆洋蔥大蒜蠶豆的根、莖、葉等。

6 每個實驗小組的用量

6.1 器材

切片機,切片刀,溫臺,恒溫箱,熔蠟爐,水浴鍋等這類幾個小組用一臺就行;解剖刀,單面刀片,小臺木,毛筆一只,蠟鏟一個,蓋玻片和載玻片30個,臉盆一個,酒精燈各一個,包埋紙盒2~3個,染色缸一個,瓷杯3個,顯微鏡一臺。

6.2 試劑

FAA固定液50ml、1%番紅100ml、1%固綠100ml、1%過碘酸100ml、Schiff試劑100ml、亞硫酸鹽300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%~1%淀粉糖化酶溶液200ml,石蠟半盒、蜂蠟10塊、埃利希蘇木精染液100ml、1%伊紅酒精溶液100ml、1%鹽酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶,甘油蛋白粘片劑數滴,中性樹膠數滴。

6.3 材料

小白鼠一只、蠶豆種,小麥和大豆種10~20粒,洋蔥和大蒜由實驗室統一種,然后取其所需部分。

7 石蠟切片法實例(一)

—蘇木精-伊紅對染法

7.1 目的要求

1、 熟悉石蠟切片的制作過程。

2、 掌握HE染色的基本原理和染色方法

7.2 實驗原理

石蠟切片是最基本的切片技術,冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法(簡稱H.E.對染法)是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛,對組織細胞的各種成分都可著色,便于全面觀察組織構造,而且適用于各種固定液固定的材料,染色后不易褪色可長期保存。經過HE染色,細胞核被蘇木素染成藍紫色,細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

7.3 實驗用品

(一) 器材

切片機,切片刀,溫臺,恒溫箱,解剖刀,鑷子,剪刀,解剖針,單面刀片,小臺木,灑精燈,包埋紙盒,染色缸,燒杯,水盆,熔蠟爐,蠟杯。

(二) 試劑

卡諾(Carnoy)固定液,埃利希蘇木精染液,1%伊紅酒精溶液,1%鹽酸乙醇液,各級酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯,甘油蛋白粘片劑,中性樹膠。

試劑配法:

1、卡諾氏固定液:

100%酒精3份

冰醋酸 1份

或:100%酒精6份

氯仿 3份

冰醋酸 1份

2、埃利希蘇木精染液的配法:

蘇木精 1g

純酒精 50ml

冰醋酸 5 ml

甘油 50 ml

鉀礬(硫酸鋁鉀)約5g(飽和量)

蒸餾水 50 ml

配法:

ⅰ、將蘇木精溶于約15 ml的純酒精中,再加冰醋酸后攪拌。

ⅱ、當蘇木精溶解后即將甘油倒入并搖動容器,同時加入其余的酒精。

ⅲ、將鉀礬在研缽中研碎并加熱,然后將它溶解于水中。

ⅳ、將溫熱的鉀礬溶液一滴一滴地加入上述染液中,并隨時攪動。

ⅴ、此液混合完畢,將瓶口用一層紗布包著小塊棉花塞起來,放在暗處通風的地方,并經常搖動以促進它的成熟。成熟時間約3~4周。若加入0.2g碘酸鈉,可立刻成熟。此液穩定而染色均勻,染核效果良好,不會發生沉淀,長期貯備無妨。此液可分別與伊紅等進行二重染色。

3、1%伊紅酒精溶液:

伊紅1g溶于100 ml95%酒精溶液。

4、1%鹽酸乙醇液

鹽酸 1份

70%酒精 100份

5、甘油蛋白貼片劑:

蛋白 50 ml

甘油 50 ml

水楊酸鈉防腐劑) 1g

配制時將雞蛋一個打破入碗或杯中,去蛋黃留下蛋白,用玻棒調打成雪花狀泡沫,然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中,經數小時或一夜,即可濾出透明蛋白液。此時在其中再加等量的甘油,稍稍振搖使兩者混合。最后加入防腐劑(水楊酸鈉)作防腐用。可保存幾個月。

(三) 材料

鼠肝

7.4 實驗程序

1、 取材

頸椎脫臼法處死小鼠,打開腹腔,剪取肝組織(或小腸)。切取的組織塊不宜太大,以便固定劑穿透,通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織,切成一小塊2~3mm厚。

取材的注意事項:

(1)取材動作要迅速,不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發生變化。

(2)切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇,盡可能不要損傷所需要的部分。

2、固定

將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下,立即投入卡諾固定液中固定,固定30~50min。

固定的注意事項:

(1)一般固定液,都以新配為好,配好后應貯存在陰涼處,不宜放在日光下,以免引起化學變化,失去固定作用

(2)有些混合固定液的成份之間會發生氧化還原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定時就沒有作用了。

(3)固定材料時,固定液必須充足,一般為材料塊的20~30倍,有些水分多的材料,中間應更換1~2次新液。

(4)材料固定完畢后,保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里,同時在容器外上標簽,并隨同材料在溶液中投入相應的標簽,以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字,應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。

1、 洗滌

材料經固定后,除乙醇外,組織中的固定液必須沖洗干凈,尤其是含有重金屬的固定液。因為殘留在組織中的固定液,有的不利于染色,有的產生沉淀或結晶影響觀察。沖洗方法根據固定液的性質而定,固定液為水溶液的常用水洗滌,固定液含有乙醇的則用50%~70%乙醇沖洗。

2、 脫水

30%、50%、70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水各40min,放入95%、100%各兩面三刀次,每次20min。各種材料經固定與洗滌后,組織中含有大量水分,由于水與石蠟不能互溶,所以必須將組織中的水分除去。

脫水注意事項

(1)脫水必須在有蓋的玻璃品中進行,防止吸收氣中的水分。

(2)在更換高一級的脫水劑時,最好不要移動材料以免損壞,可用吸管吸出器皿中的脫水劑,再用吸水吸盡器皿內剩余液,然后于皿中加入高一級脫水劑。

(3)在低濃度或純酒精中,每級停留不宜太長,否則易使組織變軟,助長材料的解體。

(4)在高濃度或純酒精中,每級停留的時間也不宜太長,否則會使組織變脆,影響切片。

(5)如需過夜,應停留在70%酒精中。

(6)脫水必須徹底,否則不易透明,甚至使透明劑內出現白色混濁現象

5、透明

純酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯0.5h(或至透明為止),須換一次二甲苯。

由于乙醇與石蠟不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟,所以脫水后還要經過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時,光線可以透過,組織呈現出不同程度的透明狀態。

透明注意事項

(1)使用透明劑時,要隨時蓋緊蓋子,以免空氣中的水分進入。

(2)更換每級透明劑,動作要迅速,一方面為了不使材料塊干涸,另一方面能避免吸收濕氣

(3)在透明過程中, 如果材料周圍出現白色霧狀,說明材料中的水未被脫凈,應退回純酒精中重新脫水,然后再透明。

6、透蠟

放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min,再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各20~30分鐘。

透蠟的目的是除去組織中的透明劑(如二甲苯等),使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以

便包埋。透蠟時間根據組織的透蠟時間較長,約需1~2d。透蠟應在恒溫箱內進行,并保持箱內溫度在55~60℃左右,注意溫度不要過高,以免組織發脆。置于恒溫箱0.5h。

透蠟注意事項

(1)盡量保持在較低溫度中進行,以石蠟不凝固為度;

(2)透蠟溫度要恒定,不可忽高忽低;

(3)操作要迅速,力求在最短的時間內完成石蠟透入過程,以免引起組織變硬、變脆、收縮等。

1、 包埋

將經過透蠟的組織連同熔化的石蠟,一起倒入容器內,然后立即投入冷水中,使其立刻凝固成蠟塊。

用于包埋的石蠟的熔點在50~60℃之間,包埋時應根據組織材料、切片厚度、氣候條件等因素,選擇不同熔點的石蠟。一般動物材料常用的石蠟熔點為52~56℃,植物材料用的石蠟熔點為54~58℃。

包埋的操作過程

包埋時,將紙盒放在已經加熱的溫臺上,從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯,倒入包埋用的紙盒中,取出存放材料的蠟杯3,迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部(注意切面朝下放置),再用溫鑷子輕輕撥動材料,使之排列整齊。輕輕將紙盒兩側的把手提起,慢慢地平放在面盆,并立即使它沉入水中,使盒中包埋塊迅速凝固。待石蠟完全凝固(約30min)后即可取出備用。

2、 切片

①將已固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機的夾物臺上。

②將切片刀固定在刀夾上,刀口向上。

③搖動推動螺旋,使石蠟塊與刀口貼近,但不可超過刀口。

④調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置,刀片與石蠟切片約成15度左右。

⑤調整厚度調節器到所需的切片厚度,一般為4~10微米。

⑥一切調整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉輪,讓蠟塊切成蠟帶,左手持毛筆將蠟帶提起,搖轉速度不可太急,通常以40~50r/min。

⑦切成的蠟帶到20~30cm長時,右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起,以免卷曲,并牽引成帶,平放在蠟帶盒上,靠刀面的一面較光滑,朝下,較皺的一面朝上。

⑧用單面刀片切取蠟片一小段,放在載玻上加水一滴,置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。

⑨切片工作結束后,應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟,把切片機擦拭干凈妥為保存。

3、 貼片

①、取一片清潔的載玻片,滴一滴粘片劑于玻片中央,然后用洗凈的手指加以涂抹,便成

均勻薄層。

②、滴1~2滴的蒸餾水已涂粘片劑的載玻片上。

③、用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶,放在水面上,注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上,并使之處于稍偏玻片的一端,另一端便于粘貼標簽。

④、把玻片擺好片位置,在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展。或放置置于預先加熱的展片臺上(溫度保持在40~45℃)。此時蠟片因受熱而伸展攤平。并使之處于稍偏玻片的一端,另一端便于粘貼標簽。

⑤、展片后把載玻片放在平盤上編好記號置于37℃溫箱烘干,一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。

10、脫蠟復水

石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5~10min,然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液中各3~5min,再放入蒸餾水中3min。

染色液多數為水溶液,因此,染色前必須將蠟脫去,使切片中的材料由有機相進入到水相。一般采用二甲苯脫蠟,逐級復水與脫水浸蠟過程正好相反,但是,由于蠟片較薄,所需時間比脫水浸蠟要短的多。

11、染色

切片放入蘇木精中染色約10~30min。染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低,適當縮短或延長。室溫高時促進染色,染色時間可短些,否則可適當延長時間,冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。

12、水洗

用自來水流水沖洗約15min。沖洗過程中使切片顏色發藍(或放入堿性水中也可,但用促藍劑對伊紅可能拒染,如果時間來得及,應以流水沖洗使切片顯示藍色為宜),但要注意流水不能過大,以防切片脫落,并隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍為止。

13、分化

就是將細胞質著的色褪去,使細胞核著色更加鮮明,也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液(鹽酸1份+70%乙醇100份)中褪色,見切片變紅,顏色較淺即可,約數秒至數十秒鐘。這一步驟是H.E.染色成敗的關鍵,,如分化不當會導致染色不勻,或深或淺,得到的切片染色效果差。如果染色適中,可取消此步驟。

14、漂洗

切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。低倍鏡檢查見細胞核呈藍色、結構清楚;細胞質或結締組織纖維成分無色為標準。然后放入蒸餾水中漂洗一次。

15、脫水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。

16、復染

用0.5%伊紅乙醇液對比染色2~5min。伊紅主要染細胞質,著色濃淡應與蘇木精染細胞

核的濃淡相配合,如果細胞核染色較濃,細胞質也應濃染,以獲得鮮明的對比。反之,如果細胞核染色較淺,細胞質也應淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染,促使細胞質容易著色,并且經乙醇脫水時不易褪色。

17、脫水Ⅱ

放入95%乙醇中洗去多余的紅色,然后放入無水乙醇中3~5min。最后用吸水紙吸干多余的乙醇。

18、透明

切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中約5min,然后放入純二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯應盡量保持無水,應經常更換,或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。切片如在二甲苯中出現白霧現象,說明脫水未盡,應退回乙醇中重新脫水,否則切片難以鏡檢。

19、封藏:中性樹膠封存

切片經染色、脫水、透明后,即可用封藏劑將其封藏起來,目的是永久保存切片,便于鏡檢。常用的封藏劑一類為干性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等,另一類為濕性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經二甲苯透明,則用樹膠作為封藏劑,樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。如果切片是直接從水中或水溶液中取出,則常用甘油明膠作為封藏劑,可用于短期保存標本

封藏的方法:

封片前應根據材料的大小,選用不同規格的蓋玻片。材料透明后,按照下列方法進行封藏。在桌上放一張潔凈的吸水紙,將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上(切片的一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴樹膠(千萬不能待二甲苯干燥后再進行),用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側,稍為傾斜使其左側與封藏劑接角,然后再緩慢地將蓋玻片放下,這樣就可以減少或避免產生氣泡。如膠液不足,可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多,可在干燥以后用刀刮去,并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。

染色結果:細胞核被蘇木素染成藍色,細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

 

8 石蠟切片法實例(二)

——番紅-固綠對染法

8.1 目的要求

1、 熟悉植物石蠟切片的制作過程。

2、 掌握番紅-固綠對染法的基本原理和具體方法。

8.2 實驗原理

石蠟切片法也是在研究植物細胞的形態結構等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片,又可以切成連續薄片,切片經染色,觀察效果甚好。番紅-固綠對染法,為

植物制片上最普遍的一種二重染色法,其染色程序簡單并能清晰地顯示出細胞的結構。番紅為堿性染料,能使細胞核及木質化細胞壁染成紅色;固綠為酸性染料,能使細胞質及纖維素的細胞壁染成綠色。

8.3 實驗用品

(一) 器材

切片刀,切片機,溫箱,溫臺,解剖刀,鑷子,單面刀片,臺木,毛筆,蠟鏟,酒精燈,包埋紙盒,染色缸,玻片盤,溫度計,臉盆。

(二)試劑

FAA固定液,1%番紅,1%固綠,各級酒精(30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%),二甲苯,石蠟,郝普特氏明膠粘片劑,樹膠。

試劑配法:

1、FAA固定液(福爾馬林-醋酸-灑精混合液)

福爾馬林 5 ml

50%或70%的灑 90 ml

冰醋酸 5 ml

此液適用于植物組織,此液中的酒精,有用50%的,也有用70%的,一般薄嫩的材料右用50%的,厚硬的材料用70%的,醋酸的用量也可根據材料情況作適當的改變,對一些大塊而密實的組織可增加用量,同時減少福爾馬林的用量。固定時間可因材料及醋酸含量的變化而異,一般為5~20h。固定的材料,一般無需用水洗,可直接從70%的酒精開始脫水。

1、 1%番紅

番紅1g溶于100ml水中。

2、 1%固綠

1g固綠溶于100ml95%酒精中。

3、 郝普特氏明膠粘片劑

明膠 1g

蒸餾水 100ml

石炭酸 2g

甘油 15ml

配制時先將明膠溶解于30℃的蒸餾水中(在水浴鍋內進行),待溶解后再加石炭酸和甘油,攪拌均勻后,趁熱過濾,貯存于玻璃瓶中。

(三)材料

大豆、小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆等。

8.4 實驗程序

1、 取材

取已培養好的大豆、小麥、蠶豆根或莖、葉等用刀片將其尖端約1.2cm根尖切割下來,用刀

片切割其成熟區部分成5mm長的小段(亦可切帶側根的部分),將切好的材料放入玻管中。

2、 固定

將FAA固定液倒入盛有材料的玻管中,固定時間為24h。

3、 沖洗

用70%酒精換洗3次,每次0.5-2h。

4、 脫水

80%、90%酒精各1-2h,純酒精(中間換一次)1-2h。

5、 透明

等量純酒精及二甲苯中1-2h,二甲苯(中間換一次)1-2h。

6、 透蠟

方法同前。

7、 包埋

方法同前。

8、 切片

根為橫切面,其厚度為8~10um。

9、 貼片。

方法同前。

10、 番紅-固綠對染法染色程序如下:

(1)切片在二甲苯中脫蠟,約10min。

(2)等量純酒精二甲苯5min。

(3)經純酒精,95%、90%、80%、70%、505、305各級酒精各5min。

(4)蒸餾水2-5min。

(5)1%番紅水溶液染色2h左右。

(6)用水洗去多余染液。

(7)50%、70%、80%、90%、95%各級酒精脫水10min。

(8)1%的固綠(用95%酒精配制)染色10-40s。

(9)95%酒精洗一下。

(10)純酒精脫水5min。

(11)等量純酒精二甲苯混合液中5min。

(12)二甲苯5min。

(13)中性樹膠封藏。

注意:

(1)番紅與固綠在酒精中很容易脫色,因此在酒精中脫水時,不能放置太久。

(2)用固綠對染之前應檢查番紅染色的是否合適,所染顏色應稍深一些,以防其在以后脫水步驟中仍會脫色,如果太淺,應退回重染。

 

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    2020/11/30 19:36:08 | #0
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