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溶血反應

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1 拼音

róng xuè fǎn yìng

免疫溶血反應是補體參與的抗體致敏紅細胞溶解反應。參與反應的成分有3種:①紅細胞,一般用綿羊紅細胞(SRBC);②抗紅細胞抗體,也稱溶血素,多為家兔抗SRBC的抗血清;③補體。

溶血反應的直接用途是測定總補體活性或溶血素的效價;也可利用溶血系統作為指示劑檢測另一反應系統的抗原或抗體,即補體結合試驗

2 溶血反應的檢測試劑

2.1 (一)補體

檢測血清補體水平或補體活性時需要從受檢者采血分離血清。做補體結合試驗時多采用豚鼠血清作為實驗用補體的來源。因為補體在體外極易衰變,所以檢測補體活性的血清標本和作為補體試劑的血清必須新鮮。

受檢者一般做靜脈采血,在動物可做心臟采血。血清分離后應及時使用,最好在當日用完。必須保存時采用小量分裝的辦法,置-70℃下可保存數月,避免反復凍融。凍干制品可長期保存,但其活性都不同程度地比新鮮血清降低。

以豚鼠血清作補體來源時,應考慮到個體差異。為了確保血清中補體的有效活性,必須取3只以上豚鼠的血清混合后使用。

2.2 (二)綿羊紅細胞

從綿羊頸靜脈無菌采血,抽出血液后立即小心地注入放有玻璃珠的無菌干燥三角燒瓶中,充分旋搖15~20min,以除去纖維蛋白。也可將羊血與等量或2倍量的Alsever血液保存液混合,既有抗凝作用,又適于儲存;分裝后置4℃,可使用3周。

實驗前,取適量抗凝血,加入8~10倍的生理鹽水,輕輕混勻后2000r/min離心5min;棄上清,沉淀的紅細胞用生理鹽水再洗一次,這時上清為無色澄清,如顯紅色說明有溶血現象,應更換新鮮羊血;第三次用緩沖液洗滌,棄上清,取壓積紅細胞用緩沖液配制SRBC懸液,使用濃度一般為2%~5%。為使紅細胞濃度標準化,可吸取少量紅細胞懸液,中入20~30倍的稀釋液中,在542nm波長比濁,以吸光度為標準調整紅細胞濃度。

2.3 (三)溶血素

溶血素即抗綿羊紅細胞抗體,多是以綿羊紅細胞免疫家兔而得到兔抗血清。一般沒有必要進一步提純抗體,但在試驗前需先進行加熱56℃30min或60℃3min以滅活補體。

由于補體溶血試驗及補體結合試驗均是比較精密的試驗,其結果與溶血素的效價有關,所以試驗需要滴定溶血素效價;在制備抗血清的過程中,于動物采血前和分離抗血清后也需要滴定溶血素效價。

1.溶血素稀釋稀釋溶血素時,要先對效價有個大概的估計,以便確定稀釋度的范圍。動物采血前滴定時稀釋范圍要稍大些,實驗前的滴定便以原先的記錄作為參考(溶血素的效價多在數千單位以上)。溶血素稀釋一般不采用連續倍比稀釋法,因為稀釋到最后時跨度太大,不容易確定單位。為了便于操作,現舉例按表14-1配制不同稀釋度的溶血素。

表14-1不同濃度溶血素的配制

最終稀釋度 緩沖液(ml) 所加溶血素
稀釋度 體積(ml)  
1:1000 1.8 1:100 0.2
1:2000 0.2 1:1000 0.2
1:3000 0.4 1:1000 0.2
1:4000 0.2 1:2000 0.2
1:5000 0.8 1:1000 0.2
1:6000 0.2 1:3000 0.2
1:8000 0.2 1:4000 0.2
1:10000 0.2 1:5000 0.2

2.效價滴定將稀釋好的溶血素及其他試劑按表14-2所示逐步加入到各試管中,放置37℃水浴,不要蓋上水浴箱的蓋子,以免蓋子上冷凝的水蒸氣滴入試管內引起非補體性溶血。30min后取出觀察結果。

表14-2溶血素的滴定

管號 溶血素稀釋度 試管內加的各種試劑材料 結果
溶血素(ml) 1:60稀釋補體(ml) 緩沖液(ml) 20%羊紅細胞(ml)  
1 1:1000 0.1 0.2 0.2 0.1 全溶
2 1:2000 0.1 0.2 0.2 0.1 全溶
3 1:3000 0.1 0.2 0.2 0.1 全溶
4 1:4000 0.1 0.2 0.2 0.1 全溶
5 1:5000 0.1 0.2 0.2 0.1 大部分
6 1:6000 0.1 0.2 0.2 0.1 微溶
7 1:8000 0.1 0.2 0.2 0.1 不溶
8 1:10000 0.1 0.2 0.2 0.1 不溶
9 (對照) 0.5 0.1 不溶

溫育反應后,完全溶血的試管內液體紅色透明,放置一段時間后管底無細胞沉淀,離心后可見少許細胞碎渣。不溶血的管內液體渾濁;放置后可見紅細胞沉淀,上清無色透明。不同程度的不完全溶血介于兩者的中間變化態。

按照以上標準,以產生完全溶血的最高稀釋管為最大有效反應管,以該管的溶血素稀釋倍數為溶血素產效價。例如表14-2中的溶血素效價應為1:4000;在1:4000稀釋的情況下,反應液中所含溶血素的的量為1U/ml。

做補體活性測定或補體結合試驗時,一般使用2U/ml溶血素(在本例做1:2000稀釋),與SRBC懸液等體積混合。

2.4 (四)稀釋緩沖液

磷酸緩沖液或巴比妥緩沖液等均可用于溶血試驗,pH值應調至7.2~7.4之間。另加入適量氯化鈉保持等滲,并適當地加入一些鈣離子和鎂離子,這是補體活化所不可缺少的。有的配方還加入0.1%的明膠以使蛋白溶液穩定;加入0.01%NaN3可以防腐,利于較長時間保存。

3 溶血反應測定補體法

3.1 (一)CH50試驗原理

補體最主要的活性是溶細胞作用,這種活性很容易通過溶血反應進行檢測。在一個適當的、穩定的反應系統中,溶血反應對補體的劑量依賴呈一個特殊的S形曲線(圖14-1)。

圖14-1溶血程度與補體含量的關系

從圖14-1可以看出,在輕微溶血和接近完全溶血時,補體量的變化不能使溶血程度有顯著改變,速溶血對補體量的變化不敏感。但在半溶血(50%溶血)上下時曲線最陡,即使補體含量僅有較小變動時,溶血程度也會發生較大的改變,也就是說對補體量的變化非常敏感。故采用50%溶血作為終點指標要比100%溶血敏感得多,這一方法稱為補體50%溶血(complementhemolysis50%),簡稱為CH50。

3.2 (二)CH50試驗方

取新鮮血清標本進行試驗。按表14-3的要求在各管中加入試劑和反應物,一起放37℃水浴箱中溫育30min。

做CH50試驗時,應同時配制50%溶血的標準管。取2%SRBC懸液0.5ml,加2.0蒸餾水,使SRBC全部溶解;再加入2.0ml1.8%NaC1溶液校正為等滲溶液;最后加入2%SRBC懸液0.5ml,即成為50%溶血狀態;混勻后取該懸液2.5ml,隨試管一起進行溫育,便是50%溶血標準管。

表14-3總補體溶血活性測定

試管號碼 1:20稀釋血清(ml) 巴比妥緩沖液(ml) 2U溶血素(ml) 2%羊紅細胞(ml)
1 0.10 1.40 0.5 0.5
2 0.15 1.35 0.5 0.5
3 0.20 1.30 0.5 0.5
4 0.25 1.25 0.5 0.5
5 0.30 1.20 0.5 0.5
6 0.35 1.15 0.5 0.5
7 0.40 1.10 0.5 0.5
8 0.45 1.05 0.5 0.5
9 0.50 1.00 0.5 0.5
10 0.00 1.50 0.5 0.5

溫育后將所有試管2500r/min離心5min,通過觀察比較,選擇溶血程度與標準管相近的兩管在分光光度計上分別讀取吸光度,以最接近標準管的那一管定為最高有效反應管,取其稀釋倍數代入下列公式,求得CH50的測定值(單位U)。

毫升血清總補體活性(單位)=×稀釋倍數

用CH50法測定總補體溶血活性時,所測得的值與反應體積成反比例關系,上例采用的液體總量為2.5ml,測得的總補體活性的參考范圍為50~100U/ml。

3.3 (三)臨床意義

CH50法主要檢測的是補體經典途徑的溶血活性,所反映的主要是補體9種成分的綜合水平。如果測定值過低或者完全無活性,首先考慮補體缺陷,可分別檢測C4、C2、C3和C5等成分的血清含量;嚴重肝病血漿蛋白合成能力受損,營養不良時蛋白合成原料不足,這些也都可以不同程度地引起血清補體水平下降。

在患系統性紅斑狼瘡類風濕性關節炎強直性脊柱炎自身免疫病時,血清補體水平隨病情發生變化。疾病活動期補體活化過度,血清補體水平下降;病情穩定后補體水平又反應性增高。另外,補體各成分在不同的自身免疫病時可有特征性的表現(詳見第二十五章),因此補體檢測常可作為自身免疫病診斷或是否有疾病活動的參考指標。

細菌感染、特別是革蘭陰性細菌感染時,常因補體旁路途徑的活化過度引起血清補體水平降低。心肌梗塞甲狀腺炎大葉性肺炎糖尿病妊娠等情況下血清補體水平常升高。

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  • 評論總管
    2019/10/23 16:56:34 | #0
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本頁最后修訂于 2012年3月12日 星期一 10:37:11 (GMT+08:00)
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