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人二倍體細胞

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1 拼音

rén èr bèi tǐ xì bāo

人二倍體細胞株來源于正常人胎兒組織,主要用于培養病毒制備疫苗等。

2 人二倍體細胞建株、檢定及制備疫苗規程

2.1 細胞株的要求

用于疫苗生產的人二倍體細胞株(以下簡稱細胞株)須按下列規定進行全面檢定。新建立細胞株,應按《新生物制品審批辦法》進行審批。

1 建立細胞株必須具備下列資料

1.1 建立細胞株所用的胎兒的胎齡和性別,中止妊娠原因。

1.2 建立細胞株所用胎兒的父、母年齡、職業及健康狀況,胎兒父、母系三代應無明顯遺傳缺陷和腫瘤疾病歷史。在取胎兒組織時,應作出詳細調查,報衛生部審批前,應進行一次重復調查。

1.3 原始組織種類,原代培養的數量與生長狀況。

1.4 細胞培養史和生長特征,細胞壽命、世代數。

1.5 細胞生長液的成分。

2 細胞株的檢定

2.1 染色體鑒定和制片

細胞原系建株過程,每8~12世代*應作一次染色體檢查,一株細胞整個生命期內連續培養過程中,至少應有4~5次染色體檢查結果。

每次染色體檢查,應從同一世代不同細胞培養瓶中取細胞混合再培養,制備染色體標本片。染色體標本應長期保存(直至褪色不能用為止),以備復查。

每次染色體檢查,至少應隨機取1000個分裂中期細胞,進行染色體數目、形態結構檢查,并作出有助于復查的記錄,其中至少選擇50個分裂中期細胞進行顯微照相,作出核型分析。并應粗數500個分裂中期細胞,檢查多倍體發生率。

可以G分帶或Q分帶技術檢查50個中期細胞染色體帶型,應用照相圖片作出帶型分析。以顯帶技術檢出的核型異常(假二倍體、倒位、易位等)發生率應用比現用上限更寬的基本數據進行評價,合格上限尚未定出。

2.1.1 合格要求

1000個和500個中醫細胞標本中,檢查異常率、合格的上限(可信限95%,Poison法)如表1。

表1

異常 檢查細胞數(個)
1000 500 100
染色單體和染色體斷裂 47 26 8
結構異常 17 10 2
超二培性 8 5 2
亞二倍性* 180 90 18
多倍性** 30 17 4

*亞二倍性超過上限時,可選用批標本片重數

**+一個中期細胞內超過53條染色體即為一個多倍體

2.1.2 染色體制片要求

應及時進行制片質量檢查,如發現細胞堆積,染色體分散不好等,由于技術原因不適于讀片時,可以及時重新制片。但已經讀片后,不斷因某項超過標準(亞二位性除外)而廢棄不算。如考慮到制片技術與質量問題,可重試兩次,當有一次結果與原結果相近時,又無可知原因,應以原結果為準。

2.2 外源因子檢查

細胞株不應有細菌霉菌、支原體和病毒等污染。每8~12世代細胞培養物,應進行下列檢查。

2.2.1 細菌、霉菌、支原體檢

按《生物制品無菌試驗規程》進行。

2.2.2 病毒檢查

2.2.2.1 細胞直接觀察及紅細胞吸附試驗

取混合瓶細胞樣品,接種小瓶或小管,長成單層后更換維持液,觀察2周,鏡檢細胞,應保持正常形態特征。培養7天,用0.2%~0.5%雞和豚鼠混合紅細胞懸液進行紅細胞吸附試驗,先置于4~8℃,后置于20~25℃,各30分鐘,兩次觀察結果均應為陰性

2.2.2.2 細胞培養檢查

細胞培養的上清液混合樣品,至少接種4種細胞(原代人腎或猴腎細胞、原代兔腎細胞、人源傳代細胞和另一批人二倍體細胞)。接種的樣品量應占維持液的20%以上,于培養5~7天和14天時,進行紅細胞吸附試驗(見2.2.2.1項)。培養7天的上清液在同種細胞培養上盲傳一代,觀察14天,應無細胞病變,紅細胞吸附試驗應為陰性(在該試驗的細胞維持液中,允許加入少量該細胞培養用的牛血清,以利細胞維持和觀察)。

2.2.2.3 動物試驗檢查

用乳鼠、成鼠、家兔、豚鼠和雞胚各一組。每組動物或雞胚接種受檢細胞不應少于107。按表2所列要求進行試驗和觀察。如80%以上動物和雞胚健存,此試驗為通過。

2.2.2.4 其他檢查

細胞株傳代過程中,至少于2個不同世代水平進行包涵體乙型肝炎表面抗原及電鏡檢查,結果均應為陰性。

2.3 腫瘤原體檢查

每8~12世代做一次細胞株的異種移植試驗,觀察細胞株有無致腫瘤性質,每次實驗使用6只乳鼠(3~5日齡)或體重8~10g小白鼠,經抗胸腺血清(ATS)處理,皮下接種活二倍體細胞(最適傳代的細胞),觀察14天,檢查有無結節形成。有結節或可疑病灶時,做病理切片檢查。試驗同時,用HeLa或其他人源傳代細胞系陽性對照試驗,用動物數與處理方法同試驗組,接種被檢二倍體細胞數應為對照腫瘤細胞數的5倍以上。結果二倍體細胞株不應有移植瘤形成,而對照組細胞則應有80%或更多的動物有典型移植瘤出現(腫瘤結節需經病理組織學診斷)。

表2

動物組別 要求 動物或雞胚數 接種途徑 接種細胞懸液量
(ml/只)
觀察天數 結果
乳鼠 24小時內 2窩≥10 腦內
腹腔
0.01
0.1
21 應健存
成鼠 12~14g 10 腦內
腹腔
0.03
0.5
21 應健存
豚鼠 350~500g 5 腹腔 5.0 42 應健存,解剖結核病變
家兔 1.5~2.5kg 5 皮內
皮下
0.1×10**
9.0
21 無異常
健存
雞胚 9~11日齡 10 尿囊 0.2 3~4 尿液血凝試驗陰性***

*豚鼠于注射前及觀察4周作舊結核菌素試驗,應為陰性

**每只于背部皮內注射10處,每處0.1ml

***應用豚鼠和雞混合紅細胞作直接血凝試驗

可以用任何以免疫抑制劑處理,并對腫瘤細胞有同樣敏感性的其他動物試驗,如無胸腺小白鼠(nude nu/nu基因型等)。

3 細胞種子

細胞株傳代過程的早期,應選定適應世代數培養出大量細胞,制成懸液,分裝安瓿作為細胞種子。置液氮中凍存,以備細胞株建成后,大量供應細胞。

凍存的種子細胞活存率應在60%以上。凍存后一定時間,應至少復蘇培養一系至衰老期,并在不同傳代水平,檢查細胞株的生長、胞核學特征、異種移植等,證明細胞經凍存后的生物學性質無明顯改變。

2.2 二倍體細胞用于疫苗生產的要求

1 細胞

1.1 細胞株

用于疫苗生產的細胞株,必須符合本規程要求。不含外源因子、核型正常、對病毒敏感和具有足夠多的細胞種子。可用KMB-17、2BS等細胞株。所用細胞株均須經衛生部批準。

1.2 細胞種子批

一個細胞種子批應有足夠量早世代細胞,分裝安瓿保存于液氮中,作為細胞種子。

2 生產用細胞種子批

用一個或數個細胞種子安瓿傳代增殖到適宜世代,具有一定量的均一細胞懸液,分裝安瓿,標明世代、安瓿號和凍存的日期,保存于液氮中,作為生產用細胞種子。

2.1 生產用細胞種子批檢定

2.1.1 細菌、霉菌、支原體檢查

按《生物制品無菌試驗規程》進行。

2.1.2 動物和雞胚檢查外源因子

用生產用細胞種子世代水平或至2/3世代壽命水平的細胞作檢定樣品。用下列動物和雞胚檢查:

乳鼠(24小時內) 2窩最少 10只
成鼠 12~14g 10只
豚鼠 350~500g 5只
家兔 1.5~2.5kg 5只
雞胚 9~11日齡 10只

各種動物和雞胚的接種法、觀察期,按照A2.2.2.3條進行。

2.1.3 腫瘤原性檢查

按A2.3項執行。

2.1.4 染色體的監測

檢查用于生產的最后一個世代或其后任一世代,至少檢查500個中期細胞的多倍性、染色體精確計數、斷裂率、結構異常及其他異常發生率,例如螺旋消失或初級次縊痕或次級次縊痕的明顯減弱等。按A2.1.1項進行評價。

生產用細胞庫細胞染色體監測用的染色體標本片和照片,應作為該細胞批監測此細胞生產疫苗批的記錄,永久保存。

3 生產用細胞的培養

3.1 從生產用細胞種子開始傳代培養,以適宜分種率連續傳代,直至增殖足夠量的細胞培養物用于生產。用于生產的細胞世代,應在細胞整個壽命期的前2/3世代內。

3.2 細胞外源因子檢查

于種毒當天,或在連續傳代種毒,于最后一次細胞種毒當天,此批細胞留取2%~5%不種毒,換維持液作為正常細胞對照,以檢查外源因子。從換液之日起觀察2周,細胞應無異常變化。

用換維持液0~2天的對照細胞上清液,接種原代兔腎、非人靈長類傳代細胞及另一批人二倍體細胞,接種樣品量應占維持液的20%。觀察14天,換液后5~8天用上清液,在相應細胞盲代一代,觀察14天,做血吸附試驗。

在收毒時,用0.2%~0.5%雞和豚鼠紅細胞,在2~8℃和20~25℃做血吸附試驗,應為陰性。

3.3 細胞鑒別試驗

在生產用細胞世代水平或其后數代,檢查300個中期細胞,計數多倍體,作100個中期細胞染色體檢查,應核型正常,鑒別確為本細胞無誤。

除染色體監測外,還可用HLA表面抗原鑒定試驗。

──────────────────

*細胞“世代”的說明:英文是“Population doubling”,簡寫“PD”,譯成“群體培增”,為通俗和習慣以名詞“世代”來表示。PD可按實際計數,增加一倍,或按細胞培養面積,增加一倍,為一個PD,即一個世代。也就是細胞以1:2分種率傳代則為一個世紀,以1:4分種率傳代則為2個世代,1:8分種率傳代則為3個世代。

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開放分類:生物制品
詞條人二倍體細胞ababab创建
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  • 評論總管
    2020/12/1 0:36:45 | #0
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本頁最后修訂于 2010年11月10日 星期三 18:43:58 (GMT+08:00)
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