凝集反應

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    1 拼音

    níng jí fǎn yìng

    2 英文參考

    agglutination

    3 概述

    凝集反應是一種血清反應顆粒性抗原(完整的病原微生物紅細胞等)與相應抗體結合,在有電介質存在的條件下,經過一定時間,出現肉眼可見的凝集小塊。參與凝集反應的抗原稱為凝集原,抗體稱為凝集素。可分為直接凝集反應和間接凝集反應兩類。

    直接凝集反應 顆粒狀抗原(如細菌、紅細胞等)與相應抗體直接結合所出現的凝集現象。分為玻片法和試管法。玻片法是一種定性試驗方法。可用已知抗體來檢測未知抗原。若鑒定新分離菌種時,可取已知抗體滴加在玻片上,將待檢菌液一滴與其混勻。數分種后,如出現肉眼可見的凝集現象,為陽性反應。該法簡便快速,除鑒定菌種外,尚可用于菌種分型、測定人類紅細胞的ABO血型等。試管法是一種定量試驗的經典方法。可用已知抗原來檢測受檢血清中有無某抗體及抗體的含量。用來協助臨床診斷或供流行病學調查研究。操作時,將待檢血清用生理鹽水連續成倍稀釋,然后加入等量抗原,最高稀釋度仍有凝集現象者,為血清的效價,也稱滴度,以表示血清中抗體的相對含量。診斷傷寒副傷寒病的肥達氏反應(Widaltest)、布氏病的瑞特氏反應(Wright test)均屬定量凝集反應。

    間按凝集反應 將可溶性抗原(或抗體)先吸附于一種與免疫無關的、一定大小的顆粒狀載體的表面,然后與相應抗體(或抗原)作用。在有電介質存在的適宜條件下,即可發生凝集,稱為間接凝集反應。用做載體的微球可用天然的微粒性物質,如人(O型)和動物(綿羊、家兔等)的紅細胞、活性炭顆粒或硅酸鋁顆粒等;也可用人工合成或天然高分子材料制成,如聚苯乙烯膠乳微球等。由于載體顆粒增大了可溶性抗原的反應面積,當顆粒上的抗原與微量抗體結合后,就足以出現肉眼可見的反應,敏感性比直接凝集反應高得多。

    4 凝集反應的特點

    細菌和紅細胞等顆粒性抗原與相應抗體結合后,可出現肉眼可見的凝集(agglutination)現象。早在1896年,Widal就利用傷寒病人的血清與傷寒桿菌發生特異性凝集的現象,有效地診斷傷寒病。至1900年Landsteriner在特異性血凝現象的基礎上發現了人類血型,并于1930年獲得了諾貝爾獎金。凝集試驗靈敏度高,方法簡便,迄今已成為通用的免疫學試驗,廣泛應用于臨床檢驗。

    凝集反應的發生分兩階段:①抗原抗體的特異結合;②出現可見的顆粒凝集。通常,細菌和紅細胞等顆粒抗原在懸液中帶弱負電荷,周圍吸引一層與之牢固結合的正離子,外面又排列一層松散的負離子層,構成一個雙層離子云。在松散層內界和外界之間的電位差形成Z電位。溶液中的離子強度愈大,Z電位也就愈大。Z電位使顆粒相互排斥。當特異抗體與相應抗原顆粒互補結合時,抗體的交聯作用克服了抗原顆粒表面的Z電位,而使顆粒聚集在一起。但當抗體分子太少,不足以克服相當厚度的離子云層時,則不能使顆粒聚集。因此在凝集反應中,IgM類抗體的作用比IgG類抗體要大數百倍,所以IgG類抗體常出現不完全反應,即不可見的抗原抗體反應。這種抗體有時又稱不完全抗體。不完全的含義是:可與抗原牢固結合,但因其分子量較小,不能起到由橋聯作用而形成的可見凝集現象。在試驗過程中,為促使凝集現象的出現,可采取以下措施:增加蛋白質電解質,降低溶液中離子強度以縮短顆粒間的距離;增加試液的粘滯度,如加入右旋糖酐或葡聚糖等;用胰酶神經氨酸酶處理,改變細胞的表面化學結構;以離心方法克服顆粒間的排斥等。

    凝集試驗是一個定性的檢測方法,即根據凝集現象的出現與否判定結果陽性或陰性;也可以進行半定量檢測,即將標本作一系列對倍稀釋后進行反應,以出現陽性反應的最高稀釋度作為滴度。由于凝集反應方法簡便,敏感度高,因而在臨床檢驗中被廣泛應用。

    在免疫學技術中,凝集反應可分為直接凝集反應和間接凝集反應兩大類。自身紅細胞凝集試驗和抗球蛋白參與的凝集試驗是兩種特殊的凝集反應。

    5 直接凝集反應

    細菌、螺旋體和紅細胞等顆粒抗原,在適當電解質參與下可直接與相應抗體結合出現凝集,稱為直接凝集反應(direct agglutination)。凝集反應中的抗原稱為凝集原(agglutinogen),抗全稱為凝集素(agglutinin)。常用的凝集試驗有玻片法和試管法兩種。

    5.1 (一)玻片凝集試驗

    玻片凝集試驗為定性試驗方法,一般用已知抗體作為診斷血清、與受檢顆粒抗原如菌液或紅細胞懸液各加一滴在玻片上,混勻,數分鐘后即可用肉眼觀察凝集結果,出現顆粒凝集的為陽性反應。此法簡便、快速,適用于從病人標本中分離得到的菌種的診斷或分型。玻片法還用于紅細胞ABO血型的鑒定。

    5.2 (二)試管凝集試驗

    試管凝集試驗為半定量試驗方法,在微生物學檢驗中常用已知細菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合,保溫后觀察每管內抗原凝集程度,通常以產生明顯凝集現象的最高稀釋度作為血清中抗體的效價,亦稱為滴度。在試驗中,由于電解質濃度和pH不適當等原因,可引起抗原的非特異性凝集,出現假陽性反應,因此必須設不加抗體的稀釋液作對照組。

    臨床上常用的直接試管凝集試驗為肥達試驗(Widal test)和外斐試驗(Weil-Felix test)。在輸血時也常用于受體和供體兩者的紅細胞和血清的交互配血試驗。

    6 間接凝集反應

    將可溶性抗原(或抗體)先吸附于適當大小的顆粒性載體的表面,然后與相應抗體(或抗原)作用,在適宜的電解質存在的條件下,出現特異性凝集現象,稱間接凝集反應(indirectagglutination)或被動凝集反應(passiveagglutination)。這種反應適用于各種抗體和可溶性抗原的檢測,其敏感度高于沉淀反應,因此被廣泛應用于臨床檢驗。

    6.1 間接凝集反應的類型

    根據致敏載體用的是抗原或抗體以及凝集反應的方式,間接凝集反應可分為4類:

    1.(正向)間接凝集反應用抗原致敏載體以檢測標本中的相應抗體(圖13-1)。

    圖13-1(正向)間接凝集反應原理示意圖

    2.反向間接凝集反應用特異性抗體致敏載體以檢測標本中的相應抗原(圖13-2)。

    圖13-2反向間接凝集反應原理示意圖

    3.間接凝集抑制反應診斷試劑為抗原致敏的顆粒載體及相應的抗體,用于檢測標本中是否存在與致敏抗原相同的抗原。檢測方法為將標本先與抗體試劑作用,然后再加入致敏的載體,若出現凝集現象,說明標本中不存在相同抗原,抗體試劑未被結合,因此仍與載體上的抗原起作用。如標本中存在相同抗原,則凝集反應被抑制(圖13-3)。同理可用抗體致敏的載體及相應的抗原作為診斷試劑,以檢測標本中的抗體,此時稱反向間接凝集抑制反應。

    圖13-3間接凝集抑制反應原理示意圖

    A:標本中含抗原B:標本中不含抗原

    4.協同凝集反應協同凝集反應(coaggoltination)與間接凝集反應的原理相類似,但所用載體既非天然的紅細胞,也非人工合成的聚合物顆粒,而是一種金黃色葡萄球菌。它的菌體細胞壁中含有A蛋白(staphylococcusprotienA,SPA)。SPA具有與IgG的Fc段結合的特性,因此當這種葡萄球菌與IgG抗體連接時,就成為抗體致敏的顆粒載體。如與相應抗原接觸,即出現反向間接凝集反應。協同凝集反應也適用于細菌的直接檢測。

    在間接凝集反應中,可用作載體的顆粒種類很多,常用的有動物或人紅細胞、細菌和多種惰性顆粒如聚苯乙烯膠乳(polystyrenelatex)、皂土(bentonite)及明膠顆粒、活性炭、火棉膠等。在臨床檢驗中最常用的為間接血凝試驗和膠乳凝集試驗。

    6.2 間接血凝試驗

    血凝試驗(hemagglutinationtest)是紅細胞凝集試驗的簡稱。間接血凝試驗是以紅細胞作為載體的間接凝集試驗,在臨床檢驗中應用廣泛,以下簡述其操作過程。

    (一)載體

    紅細胞是大小均一的載體顆粒,最常用的為綿羊、家兔、雞的紅細胞及O型人紅細胞。新鮮紅細胞能吸附多糖類抗原,但吸附蛋白質抗原或抗體的能力較差。致敏的新鮮紅細胞保存時間短,且易變脆、溶血和污染,只能使用2~3天。為此一般在致敏前先將紅細胞醛化,可長期保存而不溶血。常用的醛類有甲醛戊二醛丙酮醛等。紅細胞經醛化后體積略有增大,兩面突起呈圓盤狀。

    醛化紅細胞具有較強的吸附蛋白質抗原或抗體的能力,血凝反應的效果基本上與新鮮紅細胞相似。如用兩種不同醛類處理效果更佳。也可先用戊二醛,再用鞣酸處理。醛化紅細胞能耐60℃加熱,并可反復凍融不破碎,在4℃可保存3~6個月,在-20℃可保存一年以上。

    (二)致敏

    致敏用的抗原或抗體要求純度高,并保持良好的免疫活性。用蛋白質致敏紅細胞的方法有直接法和間接法。直接法只須在低pH,低離子濃度下,用醛化紅細胞直接吸附即可。間接法則需用偶聯劑將蛋白質結合到紅細胞上。常用偶聯劑為雙偶氮聯苯胺(bidiazotizedbenzidine,BDB)和氯化鉻。前者通過共價鍵,后者通過金屬陽離子靜電作用使蛋白質與紅細胞表面結合而達到致敏的目的。

    (三)血凝試驗

    可在微量滴定板或試管中進行,將標本倍比稀釋,一般為1:64,同時設不含標本的稀釋液對照孔。在含稀釋標本1滴的板孔(或試管)中,加入0.5%致敏紅細胞懸液1滴,充分混勻,置室溫1~2小時,即可觀察結果。凡紅細胞沉積于孔底,集中呈一圓點的為不凝集(一)。如紅細胞凝集,則分布于孔底周圍。根據紅細胞凝集的程度判斷陽性反應的強弱(圖13-4),以++凝集的孔為滴度終點。

    圖13-4血凝反應強度示意圖

    -:紅細胞沉積于孔底;+:紅細胞沉積于孔底,周圍有散在少量凝集;

    ++:紅細胞形成層凝集,面積較小,邊緣較松散;+++:紅細胞形

    成片層凝集,面積略多于++;++++:紅細胞形成片層凝集,均勻

    布滿孔底,或邊緣皺縮如花邊狀

    6.3 膠乳凝集試驗

    膠乳凝集試驗也是一種間接凝集試驗,所用的載體顆粒為聚苯乙烯膠乳,是一種直徑約為0.8μm大小的圓形顆粒,帶有負電荷,可物理性吸附蛋白分子,但這種結合牢固性差。也可制備成具有化學活性基團的顆粒,如帶有羧基的羧化聚苯乙烯膠乳等,抗原或抗體以共價鍵交聯在膠乳表面。化學交聯一般通過縮合劑碳化二亞胺將膠乳上的羧基與被交聯物上的氨基縮合在一起。這種用交聯致敏的膠乳試劑性能穩定,保存期長。

    膠乳凝集試驗分試管法與玻片法。試管法先將受檢標本在試管中以緩沖液作倍比稀釋,然后加入致敏的膠乳試劑,反應后觀察膠乳凝集結果。玻片法操作簡便,一滴受檢標本和一滴致敏的膠乳試劑在玻片上混勻后,連續搖動2~3min即可觀察結果。出現凝集大顆粒的為陽性反應,保持均勻乳液狀為陰性反應。膠乳為人工合成的載體,因此其性能比生物來源的紅細胞穩定,均一性好。但膠乳與蛋白質的結合能力以及凝集性能不如紅細胞,因此作為間接凝集試驗,膠乳試驗的敏感度不及血凝試驗。

    6.4 間接凝集反應的作用

    間接凝集反應具有快速、敏感、操作簡便、無需特殊的實驗設備等特點,而且能用于抗原或抗體的測定,因此在臨床檢驗中廣為應用。

    (一)抗原的檢測

    反向間接凝集試驗可用于檢測病原體的可溶性抗原,也可用于檢測各種蛋白質成分。間接凝集反應的敏感度雖較沉淀反應高,但低于新發展的各種標記免疫測定。因此在微量抗原測定中其實用性取決于臨床的要求。例如測定尿液HGG的膠乳凝集妊娠試驗,直接凝集法的敏感度約為300mIU/ml,凝集抑制法的敏感度約為1000mIU/ml,停經35~40天以上的孕婦可測得陽性結果。檢測乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的間接血凝試驗敏感度一般在2~5ng/ml,對獻血員的篩檢已不符合要求。

    (二)抗體的檢測

    可用于檢測細菌、病毒寄生蟲感染后產生的抗體,例如間接血凝試驗或明膠顆粒凝集試驗用于檢測抗人免疫缺陷病毒(HIV)抗體以診斷艾滋病、膠乳凝集試驗用于檢測抗溶血素O等。也有用于檢測自身免疫性疾病的抗體,例如類風濕因子膠乳凝集試驗、抗DNA抗體抗甲狀腺球蛋白抗體的間接血凝試驗等。

    7 自身紅細胞凝集試驗

    自身紅細胞凝集試驗(autologousred cell agglutination assay)與一般間接血凝試驗不同之處為反應中的紅細胞是未經致敏的受檢者新鮮紅細胞。主要試劑材料為抗人O型紅細胞的單克隆抗體,這種抗體能與不論何種血型的紅細胞結合,但不引起凝集反應。這種抗體與另一特異性抗體連接成的雙功能抗體可用于檢測標本中的抗原;如與特異性抗原連接,則可用于檢測標本中的抗體。反應中的標本為受檢者的全血。

    圖13-5 自身紅細胞凝集試驗原理示意圖

    A:檢測抗原;B:檢測抗體

    試驗的過程如下:在白色塑料片上加血液標本1滴和上述試劑1滴,混勻,2min后觀察結果,出現紅細胞凝集為陽性。反應機制見圖13-5。血液標本中的紅細胞和抗原(或抗體)分別與試劑中的抗紅細胞單克隆抗體和特異性抗體(或抗原)反應,形成網絡而導致紅細胞的凝集。

    自身紅細胞凝集試驗的特點是受檢標本為全血,不需分離血清,采指血或耳垂血進行試驗,受檢者即刻可知檢測結果。此試驗已成功地用于抗HIV抗體的檢測。也有檢測HbsAg的試劑供應,其敏感度與間接血凝試驗相仿。

    8 抗球蛋白參與的血凝試驗

    抗球蛋白參與的血凝試驗由Coombs于1945年建立,故又稱為Coombs試驗,是檢測抗紅細胞不完全抗體的一種很有用的方法。所謂不完全抗體,多半是7S的IgG類抗體,能與相應的抗原牢固結合,但在一般條件下不出現可見反應。Coombs利用抗球蛋白抗體作為第二抗體,連接與紅細胞表面抗原結合的特異抗體,使紅細胞凝集。經常用作試驗的有兩類方法。

    8.1 (一)直接Coombs試驗

    將含球蛋白的試劑直接加到紅細胞表面結合抗體的細胞懸液中,即可見細胞凝集(圖13-6)。可用玻片法定性測定,也可用試管法作半定量分析。常用于新生兒溶血癥自身免疫性溶血癥、特發性自身免疫性貧血和醫源性溶血性疾病等的檢測。

    圖13-6直接Coombs試驗

    8.2 (二)間接Coombs試驗

    用以檢測游離的血清中的不完全抗體。將受檢血清和具有待測不完全抗體相應抗原性的紅細胞相結合。再加入抗球蛋白抗體就可出現可見的紅細胞凝集(圖13-7)。此試驗多用于檢測母體Rh(D)抗體,以便及早發現和避免新生兒溶血癥的發生。亦可對紅細胞不相容的輸血所產生的血型抗體進行檢測。

    圖13-7間接Coombs試驗

    Coombs試驗除了廣泛應用于血液病的檢測外,還可采用專一特異性的抗球蛋白的血清如IgG血清、抗IgA或抗IgM以及抗補體血清等,分析結合于紅細胞上的不完全抗體的免疫球亞類。

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    • 評論總管
      2014-11-1 18:15:45 | #0
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    本頁最后修訂于 2012年3月11日 星期日 23:41:54 (GMT+08:00)
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