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免疫血清

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1 拼音

miǎn yì xuè qīng

2 英文參考

immune serum

3 概念

抗血清亦稱免疫血清。含有抗體血清制劑。

4 免疫血清的種類

抗血清種類很多,包括抗毒素抗菌血清、抗病毒血清、抗Rh血清等。

(1)抗毒素,將類毒素多次免疫動物(常用馬)后,采取動物的抗血清,經濃縮純化后制得。主要用于治療細菌外毒素所致疾病。常用的有白喉抗毒素破傷風抗毒素

(2)抗菌血清,在本世紀40年代以前曾用抗肺炎、抗百日咳、抗炭疽等抗菌血清治療有關疾病。自從磺胺類藥物和抗生素大量應用后,已極少應用于臨床治療。但對一些耐藥菌株引起的感染,可用抗菌血清治療。如對綠膿桿菌引起的感染的治療。

(3)抗病毒血清,用病毒免疫動物,取其血清精制而成。目前對病毒病的治療尚缺乏特效藥物。故在某些病毒病的早期或潛伏期,可考慮用抗病毒血清治療。如用抗狂犬病毒血清與抗狂犬疫苗同時對被狂犬嚴重咬傷者進行注射,可防止狂犬病發生。生。

(4)抗Rh血清,能作用于Rh陽性(Rh 紅細胞,臨床上常用提純的抗Rh球蛋白預防Rh新生兒溶血癥(見Rh免疫球蛋白)。

5 免疫血清的制備

5.1 動物的選擇

選擇合適的動物進行免疫極為重要。選擇時應考慮以直幾個因素:①抗原與免疫動物的種屬差異越遠越好;親緣關系太近不易產生抗體應答(如兔-大鼠之間,雞-鴨之間)。②免疫血清量的需要:大動物如馬、騾等可獲得大量血清(一頭成年馬反復采血可獲得10000ml以上的免疫血清);但有時抗體需要是不多,選用家兔或豚鼠即可。③免疫血清的要求:免疫血清可分為R型和H型。H型免疫血清用于沉淀反應較難掌握,因而極少應用。④抗原的選擇:對蛋白質抗原,大部分動物皆適合常用的是山羊和家兔。但是,在某些動物體內有類似的物質或其它原因,對這些動物免疫原性極差,如IgE對綿羊、胰島素對家兔、多種酶類(如胃蛋白酶原等)對山羊等,免疫時皆不易出現抗體。這些物質有時可以用豚鼠(如胰島素等)、火雞、甚至豬、狗、貓等作試驗免疫。⑤甾體激素免疫多用家兔;酶類免疫多用豚鼠。

5.2 免疫劑量、時間和途徑

免疫原合適劑量的選定應考慮抗原性強弱、分子大小和免疫時間。抗原需可量多,時間間隔長,劑量可適當加大。大動物抗原劑量(以蛋白抗原為準)約0.5~1mg/只,小動物約0.1~0.6mg/只。有時主觀希望加強免疫效果而不適當地加大劑量,往往會弄巧成拙。因為劑量加大極易造成免疫耐受(免疫抑制)而遭失敗。已有證明,幾微克的蛋白質也能很好地免疫出免疫血清。

免疫注射的途徑也很重要。一般采用多點注射,一只動物注射總數約為8~10點,包括足掌及肘窩淋巴結周圍,背部兩側、頜下、耳后等處皮內或皮下,皮內易引起細胞免疫反應,對提高抗體效價有利。但皮內注射較困難,特別是天冷時更難注入(因佐劑加入后粘度較大)。其他途徑還有肌內、腹腔、靜脈、腦內等,但較少應用。如抗原極為寶貴可采用淋巴結內微量注射法,抗原只需10~100μg;方法是先用不完全佐劑在足作基礎免疫(預免疫),10~15天后可見肘窩處有腫大的淋巴結(有時在腹股溝處觸及),用兩手指固定好淋巴結,消毒后用微量注射器直接注射入抗原(一般不需要佐劑)。

免疫間隔時間也是重要因素,特別是首次與第二次之間更應注意。第一次免疫后,因動物機體正處于識別抗原和B細胞增殖階段,如很快接著第二次注入抗原,極易造成免疫抑制。一般以間隔10~20天為好。二次以后每次的間隔一般為7~10天,不能太長,以防刺激變弱,抗體效價不高。對于半抗原的免疫間隔則要求較長,有的報告1個月,有的長達40~50天,這是因為半抗原是小分子,難以刺激機體發生免疫反應之故。免疫的總次數多,多為5~8次。如為蛋白質抗原,第八次免疫未獲得抗體,可在30~50天后再追加免疫一次;如仍不產生抗體,則應更換動物。半抗原需經長時間的免疫才能產生高效價抗體,有時總時間為一年以上。

5.3 動物采血法

動物免疫3~5天后,如免疫血清鑒定合格(見下節),應在末次免疫后5~7天及時采血,否則抗體將會下降。因故未及時取血,則應補充免疫一次(肌肉、腹腔或靜脈內注射,不加佐劑),過5~7天取血。

1.頸動脈放血法這是最常用的方法,對家兔、山羊等動物皆可采用。在動物頸外側做皮膚切口,拉開皮膚后可見斜行的胸鎖乳突肌,將此肌鈍性分離并推向后方,即可見到淡紅色有彈性的總動脈。將此動脈輕輕游離(連同與之同行的迷走神經),用絲線將遠心端結扎,近心端用止血鉗夾住,另一止血鉗夾住動脈迷走神經,用以固定。沿結扎處剪斷血管,用固定止血鉗將斷端放入瓶口,慢慢打開夾持的止血鉗,動脈血立即噴射入瓶。如此放血的速度快,動物死亡也快,取血量略少于其他放血法。如在放血大約總量的一半時,暫時將動脈夾住片刻,再繼續放血,得血量可以多些。

另外一種慢放血法是在動脈內插入一采血器,用閉式放血。在頸動脈內插入一較粗的玻璃管,將血管與玻璃管用線扎牢,玻璃管接一橡皮管引血入瓶,也極為方便。

2.心臟采血法此法多用于豚鼠、大鼠、雞等小動物。采血技術應熟練,穿刺不準容易導致動物急性死亡。

3.靜脈多次采血法家兔可用耳中央靜脈,山羊可用頸靜脈。這種放血法可隔日一次,有時可采集多量血液。如用耳靜脈切開法,一只家兔可采百余毫升血液(用頸動脈放血最多可獲70~80ml,一般只有50ml左右)。用頸靜脈采集綿羊血,一次可放300ml,放血后立即回輸10%葡萄糖鹽水,三天后仍可采血200~300ml。動物休息一周,再加強免疫一次,又可采血二次。如此,一只羊可獲1500~2000ml血液。小鼠取血往往采取斷尾或摘除眼球法,每鼠得血一般不超過2ml。

免疫血清的分離多采用室溫自然凝固,然后放置37℃或4℃待凝塊收縮。前者迅速,但得血清較少;后者時間長,有時還會出現溶血,但獲得血清多,而且效價不會下跌。

免疫血清分出后是否要經56℃30min滅活有兩種不同意見。一種認為血清中有許多活性酶,特別是球蛋白的降解酶,如不清除,血清存放過程中將導致抗體效價下降。另外的意見認為,這種自然降解是微不足道的,56加溫后,有些球蛋白會發生熱變性或者熱聚合。含這種聚合大分子蛋白的免疫血清用于免疫濁度試驗時,可因沉淀劑(如PEG)的加入而發生假性混濁。

6 免疫血清的鑒定

動物血采集后,立即分離出血清,此免疫血清在保存或應用前,必須作效價和特異性鑒定。

6.1 雙向免疫擴散法鑒定抗體的特異性

按雙向免疫擴散技術打兩排孔,上排放抗原粗提物(如抗原來自動物血清則放相應的混合血清)和純化抗原,下排加免疫血清,進行雙擴散18~24h后,仔細觀察上下兩排孔之間出現的沉淀線。若與粗抗原及純抗原之間皆出現一條沉淀線,且兩者互相融合,則證明該動物已產生單價特異性抗體;不出現沉淀線,表明示免疫成功。若與純化抗原出現一條,而與粗抗原出現多條線,且其中一條沉淀線與純抗原沉淀線相連接,也是成功的免疫,待取血后將雜抗體吸收去除,可以成為單價特異性抗體。

6.2 雙向免疫擴散法則定免疫血清效價

測定免疫血清效價有兩種稀釋方法:一是稀釋免疫血清,如1/2、1/4、1/8、1/16對倍稀釋,分別與一個濃度的純抗原反應;另一是稀釋抗原,即把抗原作對倍稀釋或按濃度(如mg/ml)進行稀釋,分別與不同濃度的免疫血清進行雙擴散試驗(稱為棋盤滴定),見表10-1。

表10-1免疫血清效價測定

抗原 免疫血清
不稀釋 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128  
不稀釋 +++ +++ +++ ++ ++
1/2 +++ +++ +++ ++ ++
1/4 +++ +++ +++ ++ ++
1/8 +++ ++ ++ ++
1/16 ++ ++ ++
1/32
1/64

表中+~+++代表出現沉淀線的濃度,如1:8抗體出現中等濃度沉淀線,與1:16、1:32則出現較弱的沉淀線。按表10-1的互為比例稀釋后確定免疫血清的效價為1:32,最佳抗原濃度為1:16。效價在1:8以上即可采用于一般試驗。

6.3 其他鑒定方法

有時,因抗原特殊,沉淀線不易出現,特別是制備的免疫血清將用于某種試驗時,則考慮用其它方法(如血凝試驗、抑制試驗、中和試驗、放射免疫技術等)測定其效價。

7 免疫血清的保存

免疫血清保存有三種方法。第一種是4℃保存,將免疫血清清除菌后,液體狀態保存于普通冰箱,可以存放3個月到半年,效價高時,一年之內不會影響使用。保存時要加入0.1%~0.2%NaN3防腐。如若加入半量的甘油保存期可延長。第二種方法是低溫保存,放在-20~-40,一般保存5年效價不會有明顯下降,但應防止反復凍融,反復凍融幾次則效價明顯降低。因此低溫保存應用小包裝,以備取出后在短期內用完。第三種方法是冰凍干燥,最后制品內水分不應高于0.2%,封裝后可以長期保存,一般在冰箱中5~10年內效價不會明顯降低。

8 免疫血清中抗體的純化

單價特異性是指血清只與其特異性抗原發生反應。有時免疫原不純,含有微量的雜抗原(性質相近的),制得的免疫血清中出現2~3種雜抗體。即使用純抗原,例如用高度純化的IgG免疫動物,出現的抗體總是有抗γ重鏈的抗體,也有抗κ輕鏈和抗λ輕鏈的抗體。還有一種情況,有些蛋白質和其他蛋白質處于一種結合狀態,如甲胎蛋白常和白蛋白相結合,因此免疫得到的免疫血清總是有抗白蛋白雜抗體存在。

8.1 除去雜抗體有兩種方法:

1.親和層析法將交叉雜抗原交聯到瓊脂糖珠4B上,如除去抗白蛋白抗體,則交聯上白蛋白或不含甲胎蛋白的血清,裝柱后,將預吸收的抗體通過親和層析柱,雜抗體吸附在柱上,流出液則是單價特異性抗體。

2.吸附劑方法用不含特異性抗原的抗原液,即不含用于免疫動物抗原的其他雜抗原液,如血清、組織液或已知的某種雜抗原,用雙功能試劑將其交聯,做成固相吸附劑。如用不含甲胎蛋白的血清,稀釋1倍后,加入0.25%的戊二醛丙酮醛,放冰箱一夜后,該血清成為膠凍狀,用力打碎(或用組織粉碎器),用緩沖液多次洗滌后,則成為顆粒狀凝膠吸附劑。用這種吸附劑直接加到免疫血清中(約1/10),抗原則與雜抗體結合,上清液則為無雜抗體的單價特異性抗體。有時因雜抗體太多,必須處理吸收兩次才能完全去除。吸附過的凝膠,用3mol/L硫氰酸鉀(或鈉)洗滌,洗脫掉雜抗體,可再繼續使用。

有時雜抗原較少,其他蛋白也少,加入戊二醛后不形成膠凍狀,此時可加入無關蛋白進行交聯,如牛血清蛋白兔血清、馬血清、卵白蛋白等。加入量以達到含總蛋白的2%~3%為宜。

8.2 特異性IgG抗體的制備

在標記的免疫測定或其他技術中將特異性抗體純化出來,是極為重要的。例如在ELISA,用于包被的抗體一定要用特異性IgG,才能得到良好的效果。這是因為全血清中有大量非抗體蛋白,如白蛋白、α1和α2球蛋白等,如不除去,會干擾包被。再如反相間接血凝,致敏紅細胞的抗體也需用特異性IgG的I(ab')2才能使實驗滿意。特異性IgG和F(ab')2的制備方法有如下幾種。

(一)粗提法提取球蛋白

大多用硫酸鹽析法硫酸鈉鹽析法。硫酸銨鹽析須經過多次沉淀,第一次用40%飽和度,第二次用35%飽和度,第三次用33%飽和度,經三次提取后的γ球蛋白基本是IgG成分。硫酸鈉法更簡便,用20%即可將γ球蛋白沉淀出來。經鹽析后的γ球蛋白雖大多屬于IgG,但還有5%其他區帶蛋白,如γ區的雜蛋白。又因IgG組分中還含其他所謂正常的IgG,產生干擾。因此鹽析法粗提的γ球蛋白只能用于一般的實驗,或者是抗體效價較高的免疫血清。

(二)離子交換層析法提取IgG

常用的離子交換劑有DEAE纖維素或QAE纖維素,以QAE-Sephadex最為理想,DE22、32、52也可應用。取QAE-SephadexA25或A50經酸處理并在0.05mol/LpH7.5~8.6的磷酸鹽緩沖液中平衡,將水分抽干,稱濕重Ig加于10ml血清中,在室溫30min后,離心過濾除去離子交換劑。上清液再如此處理一次,即獲得較純的IgG,甚至不含其他雜蛋白。用該技術純化IgG簡便,不損壞抗體,既可小量提取,也可大量制備。

(三)親和層析法提取特異性IgG

將純化抗原或粗制抗原(如是單價特異性則對抗原要求不高)交聯Sepharose4B制成親和層析柱,將免疫血清過柱后洗去未結合的雜蛋白,再用硫氰酸鉀洗脫,流出的是純的特異性IgG抗體。因硫氰酸鉀對抗體有破壞作用,應及時透析除去。純化的IgG因含量低,失去保護作用,應及時應用或凍干保存,亦可20℃保存,但皆不理想;加入三乙醇胺或甘油可起保護作用。

(四)酶解法制備F(ab')2片段

胃蛋白酶對IgG的作用點是在連接兩重鏈的二硫鍵靠C端處(232氨基酸處),結果兩個Fab由二硫鍵連接,保留了抗體的結合點。與IgG相比,F(ab')2的特點是去掉了Fc段,這樣在細胞免疫實驗中免除了受體作用;同時也使IgG失去主要的抗原特性,不被抗IgG抗體結合;在反向間接血凝中,用F(ab')2致敏羊紅細胞比用IgG效果好。

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開放分類:生物學
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  • 評論總管
    2019/9/20 7:23:30 | #0
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本頁最后修訂于 2012年3月14日 星期三 13:11:08 (GMT+08:00)
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