離心分離技術

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    1 拼音

    lí xīn fèn lí jì shù

    離心分離技術是借助于離心機旋轉所產生的離心力,根據物質顆粒的沉降系數、質量、密度及浮力等因子的不同,而使物質分離的技術。

    2 離心機的種類與用途

    離心機按用途有分析用、制備用及分析-制備之分;按結構特點則有管式、吊藍式、轉鼓式和碟式等多種;按轉速可分為常速(低速)、高速和超速三種。

    2.1 常速離心機

    常速離心機又稱為低速離心機。其最大轉速在8000 rpm以內,相對離心力(RCF)在104g以下,主要用于分離細胞、細胞碎片以及培養基殘渣等固形物,和粗結晶等較大顆粒。常速離心機的分離形式、操作方式和結構特點多種多樣,可根據需要選擇使用。

    2.2 高速離心機

    高速離心機的轉速為1x104~2.5x104 rpm,相對離心力達1x104~1x105g,主要用于分離各種沉淀物、細胞碎片和較大的細胞器等。為了防止高速離心過程中溫度升高而使酶等生物分子變性失活,有些高速離心機裝設了冷凍裝置,稱高速冷凍離心機。

    2.3 超速離心機

    超速離心機的轉速達 2.5x104~8x104 rpm,最大相對離心力達5x105g甚至更高一些。超速離心機的精密度相當高。為了防止樣品液濺出,一般附有離心管帽;為防止溫度升高,均有冷凍裝置和溫度控制系統;為了減少空氣阻力和摩擦,設置有真空系統。此外還有一系列安全保護系統、制動系統及各種指示儀表等。

    分析用超速離心機用于樣品純度檢測時,是在一定的轉速下離心一段時間以后,用光學儀器測出各種顆粒在離心管中的分布情況,通過紫外吸收率或折光率判斷其純度。若只有一個吸收峰或只顯示一個折光率改變,表明樣品中只含一種組分,樣品純度很高。若有雜質存在,則顯示含有兩種或多種組分的圖譜。

    分析用超速離心機可用于測定物質的沉降系數。沉降系數是指在單位離心力的作用下粒子的沉降速度。以Svedberg表示,簡稱S, 單位秒, 1S=1x10-13s。

    S可通過超速離心,根據轉速、離心時間和粒子移動的距離,按下列公式求出:

    式中ω:角速度;t2-t1:離心時間(s);X2,X1:分別為t2和t1時,運動粒子到離心機轉軸中心的距離(cm)。

    沉降系數與相對分子質量有一定的對應關系。

    3 離心分離方法的選擇

    離心分離的方法可分為三類:

    3.1 差速離心

    采用不同的離心速度和離心時間,使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法,稱為差速離心。操作時,采用均勻的懸浮液進行離心,選擇好離心力和離心時間,使大顆粒先沉降,取出上清液,在加大離心力的條件下再進行離心,分離較小的顆粒。如此多次離心,使不同大小的顆粒分批分離。差速離心所得到的沉降物含有較多雜質,需經過重新懸浮和再離心若干次,才能獲得較純的分離產物。

    差速離心主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。操作簡單方便,但分離效果較差。

    3.2 密度梯度離心

    密度梯度離心是樣品在密度梯度介質中進行離心,使密度不同的組分得以分離的一種區帶分離方法。密度梯度系統是在溶劑中加入一定的梯度介質制成的。梯度介質應有足夠大的溶解度,以形成所需的密度,不與分離組分反應,而且不會引起分離組分的凝聚、變性或失活,常用的有蔗糖甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度系統,其梯度范圍是:蔗糖濃度5%~60%,密度1.02~1.30 g/cm3。

    密度梯度的制備可采用梯度混合器,也可將不同濃度的蔗糖溶液小心地一層層加入離心管中,越靠管底,濃度越高,形成階梯梯度。離心前,把樣品小心地鋪放在預先制備好的密度梯度溶液的表面。離心后,不同大小、不同形狀、有一定的沉降系數差異的顆粒在密度梯度溶液中形成若干條界面清晰的不連續區帶。各區帶內的顆粒較均一,分離效果較好。

    在密度梯度離心過程中,區帶的位置和寬度隨離心時間的不同而改變。隨離心時間的加長,區帶會因顆粒擴散而越來越寬。為此,適當增大離心力而縮短離心時間,可減少區帶擴寬。

    3.3 等密度離心

    將CsCl2、CsSO4等介質溶液與樣品溶液混合,然后在選定的離心力作用下,經足夠時間的離心,銫鹽在離心場中沉降形成密度梯度,樣品中不同浮力密度的顆粒在各自的等密度點位置上形成區帶。前述密度梯度離心法中,欲分離的顆粒未達到其等密度位置,故分離效果不如等密度離心法好。

    應當注意的是,銫鹽濃度過高和離心力過大時,銫鹽會沉淀管底,嚴重時會造成事故,故等密度梯度離心需由專業人員經嚴格計算確定銫鹽濃度和離心機轉速及離心時間。此外,銫鹽對鋁合金轉子有很強的腐蝕性,故最好使用鈦合金轉子,轉子使用后要仔細清洗干燥

    4 離心條件的確定

    離心分離的效果好壞與諸多因素有關。除了上述的離心機種類、離心方法、離心介質及密度梯度等以外,主要的是確定離心機的轉速和離心時間。此外還要注意離心介質溶液的pH值和溫度等條件。

    4.1 離心力

    物質顆粒在離心場中所受到的離心力(Fc)的大小,決定于顆粒的質量(m)和離心加速度(ac): Fc=m ac

    離心加速度的大小取決于轉子的轉速和顆粒的旋轉半徑:ac =ω2r

    式中ω:轉子的角速度(rad/s);r:旋轉半徑,即顆粒到旋轉軸中心的距離(cm)。

    若轉速以慣用的每分鐘轉數(r/min)來表示,則:

    式中n: 轉子每分鐘轉數(r/min)

    在說明離心條件時,低速離心通常以轉子每分鐘的轉數表示,如4000 rpm;而在高速離心時,特別是在超速離心時,往往用相對離心力來表示,如65000g。

    相對離心力是指顆粒所受的離心力與地心引力(重力)之比。即

    RCF=Fc/Fg=1.12×10-5*n2*r×g

    式中RCF:相對離心力(g);n:轉子每分鐘轉數(rpm); r:旋轉半徑(cm);g:重力加速度,980.6 cm/s2

    由此可見,離心力的大小與轉速的平方及與旋轉半徑成正比。在轉速一定的條件下,顆粒離軸心越遠,其所受的離心力越大。在離心過程中,隨著顆粒在離心管中移動,其所受的離心力也隨著變化。在實際工作中,離心力的數據是指其平均值。即是指在離心溶液中點出顆粒所受的離心力。

    4.2 離心時間

    離心時間的概念,依據離心方法的不同而有所差異。對于差速離心來說,是指某種顆粒完全沉降到離心管底的時間。對等密度梯度離心而言,離心時間是指顆粒完全到達等密度點的平衡時間;而密度梯度離心的時間則是指形成界限分明的區帶的時間。

    密度梯度離心和等密度梯度離心所需的區帶形成時間或平衡時間,影響因素很復雜,可通過實驗來確定。差速離心所需的沉降時間可通過計算求得。

    顆粒的沉降時間是指顆粒從離心樣品液面完全沉降到離心管底所需的時間,又稱澄清時間。沉降時間決定于顆粒沉降速度和沉降距離。

    對于已知沉降系數的顆粒,其沉降時間可由下列公式計算:

    式中 t:沉降時間(s);S:顆粒的沉降系數(1x10-13S);ω:轉子角速度(rad/s);r1,r2:分別為旋轉軸中心到樣品液液面和離心管底的距離(cm)。

    上式中括號部分對特定轉子而言唯一常數,稱轉子效率因子或K值。即

    轉子的效率因子K 與轉子的半徑和轉速有關。對于具有某一沉降系數S的顆粒而言,K值越小,其沉降時間越短,轉子的使用效率就越高。

    對于不知其沉降系數的球形顆粒,可按下是估算其沉降時間:

    式中T:沉降時間(s);μ:介質溶液的黏度(g/(cm.s));ρ,ρ0:分別為顆粒和介質溶液密度(g/cm3);d:顆粒平均直徑(cm);r1,r2:分別為旋轉軸中心到離心管底和液面的距離(cm)。

    4.3 溫度和pH值

    為了防止欲分離物質的凝集、變性和失活,除了在離心介質的選擇方面加以注意外,還必須控制好溫度及介質溶液的Ph值等離心條件。離心溫度一般控制在4℃左右,對于某些熱穩定性較好的酶等,離心也可在室溫下進行。但在超速或高速離心時,轉子高速旋轉會發熱從而引起溫度升高。故必須采用冷凍系統,使溫度保持在一定范圍內。離心介質溶液的pH值應該是處于酶穩定性的pH范圍內,必要時可采用緩沖液。另外,過酸或過堿還可能引起轉子和離心機的其他部件的腐蝕,應盡量避免.

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    • 評論總管
      2014-12-18 3:53:31 | #0
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