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基因探針

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1 拼音

jī yīn tàn zhēn

2 英文參考

probe

基因探針(probe)就是一段與目的基因DNA互補的特異核苷酸序列,它可以包括整個基因,也可以僅僅是/基因的一部分;可以是DNA本身,也可以是由之轉錄而來的RNA

3 探針的來源

DNA探針根據其來源有3種:一種來自基因組中有關的基因本身,稱為基因組探針(genomic probe);另一種是從相應的基因轉錄獲得了mRNA,再通過逆轉錄得到的探針,稱為cDNa 探針(cDNa probe)。與基因組探針不同的是,cDNA探針不含有內含子序列。此外,還可在體外人工合成堿基數不多的與基因序列互補的DNA片段,稱為寡核苷酸探針。

4 探針的制備

進行分子突變需要大量的探針拷貝,后者一般是通過分子克隆(molecular cloning)獲得的。克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細胞或分子的大量復制品。當制備基因組DNA探針進,應先制備基因組文庫,即把基因組DNA打斷,或用限制性酶作不完全水解,得到許多大小不等的隨機片段,將這些片段體外重組到運載體噬菌體質粒等)中去,再將后者轉染適當的宿主細胞如大腸肝菌,這時在固體培養基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑,通過原位雜交,從中可篩出含有目的基因片段的克隆,然后通過細胞擴增,制備出大量的探針。

為了制備cDNA 探針,首先需分離純化相應mRNA,這從含有大量mRNA的組織、細胞中比較容易做到,如從造血細胞中制備α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后,在逆轉錄酶作用下,就可以合成與之互補的DNA(即cDNA),cDNA與待測基因的編碼區有完全相同的堿基順序,但內含子已在加工過程中切除。

寡核苷酸探針是人工合成的,與已知基因DNA互補的,長度可從十幾到幾十個核苷酸的片段。如僅知蛋白質氨基酸順序量,也可以按氨基酸的密碼推導出核苷酸序列,并用化學方法合成。

5 探針的標記

為了確定探針是否與相應的基因組DNA雜交,有必要對探針加以標記,以便在結合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標記探針的某種核苷酸α磷酸基。但近年來已發展了一些用非同位素如生物素地高辛配體等作為標記物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素標記的優點是保存時間較長,而且避免了同位素的污染。最常用的探針標記法是缺口平移法(nick translation)。首先用適當濃度的DNA酶Ⅰ(DNAseⅠ)在探針DNA雙鏈上造成缺口,然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ(DNa poly merasⅠ)的5’→3’的外切酶活性,切去帶有5’磷酸的核苷酸;同時又利用該酶的5’→3’聚酶活性,使32P標記的互補核苷酸補入缺口,DNA聚合酶Ⅰ的這兩種活性的交替作用,使缺口不斷向3’的方向移動,同時DNA鏈上的核苷酸不斷為32P標記的核苷酸所取代。

探針的標記也可以采用隨機引物法,即向變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機DNA小片段,作為引物,當后者與單鏈DNA互補結合后,按堿基互補原則不斷在其3’OH端添加同位素標記的單核苷酸,這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。

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  • 評論總管
    2019/10/19 11:33:31 | #0
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