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結核分枝桿菌

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目錄

1 拼音

jié hé fēn zhī gǎn jūn

2 英文參考

mycobacterium tuberculosis

3 概述

結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis)簡稱結核桿菌,是人類結核病的病原菌[1]。結核分枝桿菌的形態為細長直或稍彎曲、兩端圓鈍的桿菌,長1μm~4μm,寬0.3μm~0.6μm[1]

4 結核分枝桿菌的形態與染色特性

[1]

結核分枝桿菌細長略彎曲,聚集呈分枝狀排列增殖。因其細胞壁含有大量脂質,不易著色,經萋一尼氏抗酸染色呈紅色,無菌毛和鞭毛,不形成芽孢(胞),現證明有莢膜。單在,成雙,間或成叢排列。在人工培養基上,由于菌型、菌株和環境條件不同,可出現多種形態,如近似球形、棒狀或絲狀。在電鏡下觀察其具有復雜結構:由微莢膜、細胞外殼的三層結構、胞漿膜、胞漿、間體、核糖體及中間核質構成。

典型的結核分枝桿菌的形態為細長稍彎曲或直的,兩端圓鈍的桿菌,長1μm~4μm,寬0.3μm~0.6μm,單個散在,有時呈X、Y形或條索狀。痰標本涂片經過抗酸染色后在100倍的生物顯微鏡下可以看到。

結核分枝桿菌在體內外青霉素環絲氨酸溶菌酶誘導,可影響細胞壁中肽聚糖的合成,異煙肼影響分枝菌酸的合成,巨噬細胞吞噬結核分枝桿菌后溶菌酶的作用可破壞肽聚糖,均可導致其變為L型,呈顆粒狀或絲狀。

5 結核分枝桿菌的培養特性

[1]

結核分枝桿菌為專性需氧菌,營養要求高,最適pH以6.5~6.8為宜,生長緩慢,初次分離需要營養豐富的培養基。常用的有羅氏固體培養基,內含蛋黃、甘油馬鈴薯、無機鹽和孔雀綠等。孔雀綠可抑制雜菌生長,便于分離和長期培養。蛋黃含脂質生長因子,能刺激生長。根據接種菌多少,一般2周~4周可見菌落生長。在固體培養基上菌落呈灰黃白色,干燥顆粒狀,顯著隆起,表面粗糙皺縮、菜花狀的菌落。在液體培養基內,于液面形成粗紋皺膜,培養基保持透明。若加入吐溫80于培養基中,可使結核桿菌呈分散均勻生長,一般1周~2周即可生長。臨床標本檢查液體培養比固體培養的陽性率高數倍。菌體為細長略彎的桿菌,經抗酸染色染成紅色。對干燥的抵抗力特別強,對酸堿有較強的抵抗力,易產生耐藥性變異L型細菌

6 結核分枝桿菌的生化特性

[1]

結核桿菌不發酵糖類,能產生過氧化氫酶。對人致病的結核分枝桿菌現一般認為有人型、牛型、非洲型。人型與牛型菌形態相似,對豚鼠皆有較強致病力,但人型菌對家兔致病力遠較牛型菌為弱。人型結核桿菌能合成煙酸,還原硝酸鹽,耐受噻吩-9-羧酸酰肼,牛型結核桿菌都不具備上述特性。人型和牛型的毒株,中性紅試驗均陽性,無毒株,則中性紅陰性且失去索狀生長現象。熱觸酶試驗對區別結核分枝桿菌與非結核分枝桿菌有重要意義。結核分枝桿菌大多數觸酶試驗陽性,而熱觸酶試驗陰性,非結核分枝桿菌則大多數兩種試驗均陽性。熱觸酶試驗檢查方法是將濃的細菌懸液置68℃水浴加溫20 min,然后再加H2O2。觀察是否產生氣泡,有氣泡者為陽性。牛型結核分枝桿菌可經飲用未消毒的帶菌牛乳引起腸道結核感染。顯微鏡下均為抗酸桿菌,細長稍彎,有時見人字型、Y型分枝,培養生長經生化試驗可以鑒別菌型。

7 結核分枝桿菌的抵抗力

[1]

結核分枝桿菌對酸、堿、自然環境和干燥有抵抗力,但對濕熱酒精紫外線敏感,對抗結核藥物易產生耐藥性。結核分枝桿菌細胞壁中含有脂質,故對乙醇敏感。75%酒精作用5 min~30 min死亡,液體中加熱62℃~63℃,30 min死亡。結核分枝桿菌對紫外線敏感,直接日光照射2 h~7 h可被殺死。紫外線可用于結核患者衣服、書籍等的消毒。

結核分枝桿菌在干燥痰內可存活6個月~8個月,對抗結核藥物易產生耐藥性。結核分枝桿菌的抵抗力與環境中有機物的存在有密切關系,如痰液可增強結核分枝桿菌的抵抗力。因大多數消毒劑可使痰中蛋白質凝固,包在細菌周圍,使細菌不易被殺死。5%石炭酸在無痰時30 min可殺死結核分枝桿菌,有痰時需要24h; 5%來蘇兒無痰時5 min殺死結核分枝桿菌,有痰時需要1 h~2 h。

結核分枝桿菌對酸(3% HC1或6% H2SO4)或堿(4%NaOH)有抵抗力,15 min不受影響。可在分離培養時用于處理有雜菌污染的標本和消化標本中的黏稠物質。結核分枝桿菌對1:13000孔雀綠有抵抗力,加在培養基中可抑制雜菌生長。結核分枝桿菌對鏈霉素、異煙肼、利福平、環絲氨酸、乙胺丁醇卡那霉素、對氨基水楊酸等敏感,但長期用藥容易出現耐藥性。

8 結核分枝桿菌的變異性

[1]

結核分枝桿菌變異性包括:

a) 耐藥性變異:結核分枝桿菌對抗結核藥物較易產生耐藥性,造成耐藥菌株增多,給治療造成困    難。

b) 毒力變異:將有毒的牛分枝桿菌培養于含甘油、膽汁、馬鈴薯的培養基中,經230次移種傳代,    歷時13年而獲得了減毒活菌株,即卡介苗,目前廣泛用于人類結核病的預防。

9 結核分枝桿菌的致病性

[1]

結核分枝桿菌不產生內、外毒素。其致病性可能與細菌在組織細胞內大量繁殖引起的炎癥,菌體成分代謝物質的毒性以及機體對菌體成分產生的免疫損傷有關。致病物質與莢膜、脂質和蛋白質有關。

9.1 莢膜

莢膜的主要成分為多糖,部分脂質和蛋白質。其對結核分枝桿菌的作用有:①莢膜能與吞噬細胞表面的補體受體3 (CR3)結合,有助于結核分枝桿菌在宿主細胞上的黏附與入侵;②莢膜中有多種酶可降解宿主組織中的大分子物質,供入侵的結核分枝桿菌繁殖所需的營養;③莢膜能防止宿主的有害物質進入結核分枝桿菌,甚至如小分子NaOH也不易進入。故結核標本用4% NaOH消化時,一般細菌很快殺死,但結核分枝桿菌可耐受數十分鐘。結核分枝桿菌入侵后莢膜還可抑制吞噬體溶酶體的融合。

9.2 脂質

據實驗研究,細菌毒力可能與其所含復雜的脂質成分有關,特別是糖脂更為重要。①索狀因子:是分枝菌酸和海藻糖結合的一種糖脂。能使細菌在液體培養基中呈蜿蜒索狀排列。此因子與結核分枝桿菌毒力密切相關。它能破壞細胞線粒體膜,影響細胞呼吸,抑制白細胞游走和引起慢性肉芽腫。若將其從細菌中提出,則細菌喪失毒力。②磷脂:能促使單核細胞增生,并使炎癥灶中的巨噬細胞轉變為類上皮細胞,從而形成結核結節。⑧硫酸腦苷脂(sulfatide):可抑制吞噬細胞中吞噬體與溶酶體的結合,使結核分枝桿菌能在吞噬細胞中長期存活。④蠟質D:是一種肽糖脂和分枝菌酸的復合物,可從有毒株或卡介苗中用甲醇提出,具有佐劑作用,可激發機體產生遲發型超敏反應

9.3 蛋白質

抗原性,和蠟質D結合后能使機體發生超敏反應,引起組織壞死和全身中毒癥狀,并在形成結核結節中發揮一定作用。

10 結核分枝桿菌的免疫反應

[1]

結核分枝桿菌是胞內感染菌,其免疫主要是以T細胞為主的細胞免疫。T細胞不能直接和胞內菌作用,先與感染細胞反應,導致細胞崩潰,釋放出結核分枝桿菌。機體對結核分枝桿菌雖能產生抗體,但抗體只能與釋出的細菌接觸起輔助作用。

10.1 免疫反應

一直以來認為在天然免疫中巨噬細胞是結核感染的主要的靶細胞,也是機體抗結核感染的最早起作用和最具有代表性的細胞群。但隨著研究的深入,發現在結核感染的發展中有重要作用的其他細胞群,如中性粒細胞,是最早被征集到炎癥部位,通過氧依賴的殺菌物質和胞外捕獲機制來殺病原微生物。而且有研究者在感染實驗動物前,將中性粒細胞去除,結果分支桿菌生長增加;反之,實驗前用刺激中性粒細胞增殖的試劑,則分枝桿菌生長率降低。以及后來在中性粒細胞中發現了防御素。然而,中性粒細胞不只是有這種對機體的保護作用,還有些報道顯示由于不同宿主對結核桿菌的敏感性的不同,中性粒細胞的病理損傷作用會超過其保護作用。細胞免疫反應針對結核桿菌,如同其他胞內感染菌一樣,細胞介導的免疫反應比抗體介導的免疫反應更重要。于是通常會認為結核桿菌存在胞內不能與抗體結合,因此體液免疫反應對結核感染的機體沒有保護作用。但是事實并非如此,抗體對于胞內菌感染的作用越來越得到研究者們的關注,以期得到有關結核免疫機制的更深入理解。在抗結核的細胞免疫反應中,主要參與的細胞是CD4+和CD8+T細胞。巨噬細胞中結核桿菌通過MHC Ⅱ類分子抗原提呈給CD4+T細胞,被早期細胞因子如IL-12、IL-18等誘導向Thl型細胞分化。這種CD4+T細胞能夠產生大量的IFN-r等細胞因子,激活巨噬細胞,加速吞噬和殺滅結核桿菌。另外有研究說明CD4+T細胞還參與被感染的細胞的凋亡。抗原特異的溶細胞性CD4+T細胞殺滅吞噬了結核桿菌的巨噬細胞,其中對細胞的溶解會導致細菌的擴散,但是釋放出的細菌又會被機體中的其他巨噬細胞吞噬,這樣形成的一個惡性循環;只有調節巨噬細胞和溶細胞性T細胞活化之間平衡才能利于感染的控制。總的來說,CD4+T細胞在機體抗結核感染起著重要作用,當例如HIV感染的病人,缺乏CD4+T細胞時,結核感染便不能控制。對于CD8+T細胞對結核感染的控制作用主要是產生顆粒溶素(granulysin)和穿孔素來直接殺滅結核桿菌;還有r/6 T細胞,在天然免疫和適應性免疫起連接作用,其作用不僅僅是產生細胞因子和細胞毒性作用,還可以維持宿主細胞的完整性和內環境穩態。另外還有些調節性T細胞和單核細胞都能產生免疫抑制性的細胞因子TGF-β,可以被manLAM刺激分泌增加,下調調節炎癥反應,利于結核桿菌的生存。

10.2 免疫與超敏反應

結核分枝桿菌所致免疫應答的特點,是機體對結核分枝桿菌產生特異性免疫的同時,也產生了遲發型超敏反應。  隨著機體對結核分枝桿菌產生保護作用的同時,也可以看到有遲發型超敏反應的產生,二者均為T細胞介導的結果。從郭霍現象(Koch phenomenon)可以看到,將結核分枝桿菌初次注入健康豚鼠皮下,10 d~14 d后局部潰爛不愈,附近淋巴結腫大,細菌擴散至全身,表現為原發感染的特點。若以結核分枝桿菌對以前曾感染過結核的豚鼠進行再感染,則于1 d~2 d內局部迅速產生潰爛,易愈合。附近淋巴結不腫大,細菌亦很少擴散,表現為原發后感染的特點。可見再感染時潰瘍淺、易愈合、不擴散,表明機體已有一定免疫力。但再感染時潰瘍發生快,說明在產生免疫的同時有超敏反應的參與。近年來研究表明結核分枝桿菌誘導機體產生免疫和超敏反應的物質不同。

10.3 免疫學檢測

1976年Bassau等首次用結核桿菌培養濾液,即PPD結核菌素純蛋白衍生物)作抗原,以ELISA法檢測89例肺結核患者及48例正常人血清中的結核抗體敏感性為57%,特異性為98%。由于ELISA法簡便易行快速,且無需精密儀器,在結核病血清學診斷方面應用最多應用最廣。據報告ELISA法檢測結核抗體的敏感性為62.0%~94.7%,但結核分枝桿菌L型感染者OT或PPD實驗常呈陰性。目前可以采用免疫熒光法和膠乳凝集試驗檢驗,兩者在抗體稀釋度很高時,仍呈陽性反應,這與非結核分枝桿菌L型或其他細菌 L型的表現明顯不同。

11 結核分枝桿菌的耐藥機制

[1]

目前對于結核桿菌耐藥機制的研究很多,但主要有以下3種觀點:細胞壁結構與組成發生變化,使細胞壁通透性改變,藥物通透性降低,產生降解或滅活酶類,改變了藥物作用靶位;結核桿菌中存在活躍的藥物外排泵系統,外排泵將菌體內藥物泵出,使得胞內藥物濃度不能有效抑制或殺死結核桿菌,從而產生耐藥性;結核桿菌基因組上編碼藥物靶標的基因或藥物活性有關的酶基因突變使藥物失效從而產生耐藥性,這是結核桿菌產生耐藥性的主要分子機制。

12 分枝桿菌細菌學檢查

[1]

12.1 痰標本的采集、運送和保存

12.1.1 痰標本的采集

采集步驟如下:

a) 即時痰為患者就診時深呼吸后咳出的痰液,清晨痰為清晨晨起立即用清水漱口后深咳出的痰液,

夜間痰為送痰前一日夜間咳出的痰液;合格的痰標本應是膿樣、干酪樣或膿性黏液樣性質的痰液,痰量以3 mL~5 mL為宜。

b) 痰標本應由檢驗人員或經培訓合格的專人驗收,痰液不合格者,要求重新送檢;當難以獲得合格標本時,也應進行細菌學檢查,但應注明標本性狀,以便分析結果時參考。

c) 留取痰標本的容器應采用國際通用螺旋蓋痰瓶,或選用直徑40 mm、高20 mm有螺旋蓋可密封塑料盒,容器上應注明患者姓名、編號、檢查項目、痰標本序號及送檢日期。

12.1.2 痰標本的運送

留取痰標本后,應將容器密封,切勿倒置,以防痰液外溢;需外送檢查的標本應認真核對痰盒上的標注是否正確清晰,是否與檢驗單一致,痰容器應采用專用的運輸盒運送。

12.1.3 痰標本的保存

當天不能檢查的痰標本應置4℃冰箱內保存

12.2 萋-尼氏抗酸染色顯微鏡檢查

12.2.1 檢驗目的

檢測樣本中有無分枝桿菌,用于結核病的診斷。

12.2.2 方法原理

分枝桿菌的染色鏡檢可以使用不同的染料,但均是依據分枝桿菌細胞膜含脂質較多,其中主要成分為分枝菌酸,菌酸具有抗酸性,染料將分枝桿菌染色后,分枝桿菌細胞膜能抵抗鹽酸乙醇等脫色劑作用,使分枝桿菌能保持染料的顏色。分枝桿菌抗酸性是菌體內的分枝菌酸、RNA白及其細菌壁的完整性相結合的綜合反應,即抗酸性的強弱除與細菌壁的完整性有關以外,還與其細菌成熟衰老程度有關。

萋一尼氏染色法,是復紅染色液在石炭酸的協同作用下,并對標本加熱促進染色劑同被染細胞的結合,將抗酸桿菌染成紫紅色,隨后使用酸性酒精脫色,抗酸桿菌能保持紫紅色,而其他脫落細胞或標本中的非抗酸桿菌被酸性酒精脫去顏色,后經復染劑亞甲蘭復染為藍色,光學鏡下觀察,可在藍色背景下看到紫紅色的桿狀抗酸菌。

12.2.3 檢測樣品

12.2.3.1
12.2.3.1.1 其他類型臨床標本

包括胸水、腹水尿液腦脊液胃液膿液(分泌物、穿刺液等)、病理組織或干酪塊、糞便和咽喉棉拭子、支氣管洗液等臨床標本。

12.2.3.1.2 分枝桿菌培養物

液體和固體分枝桿菌培養物(形態學鑒定)。

12.2.4 檢測設備儀器

生物安全柜離心機、天平、高壓滅菌器、冰箱、顯微鏡、渦旋振蕩器。 B.2.5 檢測試劑材料及配制方法材料如下:

a) 0.8%堿性復紅染液:

1) 堿性復紅乙醇儲存液:8g堿性復紅溶于95%酒精溶液100 mL中,充分振蕩使復紅溶解,避光保存。

2) 5%石碳酸水溶液:50℃水浴加熱溶解石碳酸,5g石碳酸溶于90 mL蒸餾水中,待溶液冷卻至室溫,補充蒸餾水至100 mL。

3) 堿性復紅染色應用液:10 mL堿性復紅乙醇儲存液與90 mL 50/石碳酸水溶液混合,用定性濾紙過濾

b) 5%鹽酸乙醇脫色液:

35%濃鹽酸5 mL緩慢加入95%乙醇95 mL中混合。

c) 0.06%亞甲蘭復染液:

1) 亞甲蘭儲存液:0.3 g亞甲蘭溶于95%乙醇50 mL中,完全溶解后加蒸餾水至終體積100mL;

2) 亞甲蘭復染液:以蒸餾水5倍稀釋0.3%亞甲蘭儲存液,用定性濾紙過濾即得亞甲蘭復染液;

d) 磨砂載玻片、竹簽、2B鉛筆、鏡油、染色架、玻片盒等。

12.2.5 操作步驟

12.2.5.1 涂片制備

1.直接涂片法,步驟如下:

a) 使用一端有磨砂面的無劃痕的新玻片,經95%乙醇脫脂,干燥、清潔后備用;

b) 用2B鉛筆在磨砂面上注明實驗序號及標本序號;

c) 確保玻片的編號與痰盒上的編號相同;

d) 生物安全柜中,小心打開承載痰標本的容器,防止產生氣溶膠或使標本外溢;

e) 仔細觀察標本,使用折斷的竹簽茬端,挑取痰標本中干酪樣、膿樣或可疑部分約0.05 mL,于玻片正面輕輕環狀均勻涂抹成10 mm×20 mm的卵圓形痰膜(見圖B.1);

f) 痰膜朝上靜置在生物安全柜中,自然干燥后(一般約需要30 min)進行染色鏡檢;

g) 涂抹完畢后的痰標本,在結果報告前應暫時保留。

示意圖.png

圖B.1 制備好的痰涂片示例

2.離心沉淀集菌涂片法

留取的痰標本,經高壓蒸汽(1.0 kg/cm2,121℃15 min~20 min)液化和滅活處理,取出放冷后,取5 mL~10 mL盛于容積為50 mL的離心玻管中加滅菌蒸餾水20 mL~30 mL,振蕩器上振蕩5 min~10 min,在3000 g離心15 min~30 min,使結核分枝桿菌集中于試管底部,取沉淀物涂片。

3.其他類型臨床標本,步驟如下:

a) 膿液:同痰液涂片;

b) 病理組織或干酪塊:先用組織研磨器研磨后再進行涂片;

c) 尿液:送檢標本應首先靜置2 h~4 h,取沉淀部分約20 mL~50 mL,3000 g離心20 min~30 min,取沉淀涂片;

d) 胸、腹水標本:參照尿液涂片;

e) 腦脊液:無菌操作收集腦脊液,置冰箱或室溫24 h,待薄膜形成后進行涂片;或將腦脊液經3000 g離心20 min~30 min,取沉淀涂片檢查;

f) 糞便:標本與生理鹽水混合后,充分振蕩使之成為混懸液;定性濾紙過濾后,濾液經3000 g 離心20 min~30 min,沉淀進行涂片檢查;

g) 咽喉棉拭子:棉拭子放入無菌試管中,加入適量生理鹽水浸泡,并強烈振蕩,取出棉拭子后,液體在3000 g離心20 min~30 min,沉淀進行涂片檢查;

12.2.5.2 抗酸染色

步驟如下:

a) 固定:涂片自然干燥后,放置在染色架上,玻片間距保持10 mm以上的距離;加熱固定(在5s內將玻片經過火焰加熱4次)。

b) 初染:滴加石碳酸復紅染液蓋滿痰膜,加熱至出現蒸氣后,停止加熱,保持染色5 min。染色期間應始終保持痰膜被染色液覆蓋,必要時可續加染色液。加熱時勿使染色液沸騰。高海拔地區應適當增加加熱次數和染色時間。

c) 水洗:流水自玻片一端輕緩沖洗,沖去染色液,瀝去標本上剩余的水。

d) 脫色:自痰膜上端外緣滴加脫色劑蓋滿玻片,脫色1 min;如有必要,流水洗去脫色液后,再次脫色至痰膜無可視紅色為止。

e) 水洗:流水自玻片一端輕緩沖洗,沖去脫色液,瀝去玻片上剩余的水。

f) 復染:滴加亞甲藍復染液,染色30 s。

g) 水洗:流水自玻片一端輕緩沖洗,沖去復染液,然后瀝去標本上剩余的水。待玻片干燥后鏡檢。

h) 效果:一張染色合格的玻片,痰膜肉眼觀為亮藍色,無紅色斑塊

12.2.5.3 顯微鏡檢查

步驟如下:

a) 使用10倍目鏡雙目顯微鏡讀片。

b) 取染色完畢且已干燥的玻片,痰膜向上放置在玻片臺上并以卡尺固定。

c) 首先使用40×物鏡,轉動卡尺移動玻片至痰膜左端,將光線調節至適當亮度,調節焦距至可見    細胞形態。

d) 移開40×物鏡,在玻片上滴1~2滴鏡油,使用100X油鏡進行細致觀察,應避免油鏡鏡頭直接接觸玻片上的痰膜。

e) 讀片時,首先應從左向右觀察相鄰的視野,當玻片移動至痰膜一端時,縱向向轉換一個視野,然后從右向左觀察,依此類推(見圖B.2)。通常20 mm的痰膜,使用100×油鏡,每橫行約有100個視野。

f) 在淡藍色背景下,抗酸菌呈紅色,其他細菌和細胞呈藍色。

g) 仔細觀察完300個視野,一般需要5 min以上,每個工作日,一位鏡檢人員的玻片閱讀量不應超過25張,且連續閱讀10~12張玻片后,應休息20 min左右。

示意圖.png

圖B.2 鏡檢讀片移動方式

12.2.6 結果判讀

萋-尼氏染色抗酸桿菌陰性:連續觀察300個不同視野,未發現抗酸桿菌;

萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性抗酸桿菌菌數:1~8條/300視野;

萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性(1+):3~9條/100視野,連續觀察300個視野;

萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性(2+):1~9條/10視野,連續觀察100個視野;

萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性(3+):1~9條/1視野;

萋-尼氏染色抗酸桿菌陽性(4+):≥10條/1視野。

報告1+時至少觀察300個視野,報告2+至少觀察100個視野,3+、4+時至少觀察50個視野。

不典型抗酸菌(如:顆粒體、絲狀體、巨球體等),按實際觀察情況描述報告結果。例如:萋-尼氏染色陽性顆粒體(2+)

12.2.7 質量控制

涂片鏡檢質量保證要按照《中國結核病防治規劃·痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》要求的程序和頻度執行。

12.3 熒光染色顯微鏡檢查

12.3.1 檢驗目的

檢測樣本中分枝桿菌,用于結核病的診斷。

12.3.2 方法原理

分枝桿菌在金胺“0”染液染色后,在含有紫外光源的熒光顯微鏡下發出橘黃顏色,高倍鏡(物鏡40倍目鏡10倍)下,可見分枝桿菌產生黃綠色熒光,呈桿狀或分枝狀。

12.3.3 檢測樣品

同萋-尼氏抗酸染色。

12.3.4 設備儀器

熒光顯微鏡。

12.3.5 試劑材料

12.3.5.1 熒光染色液配制

材料如下:

a) 金胺“0”染液:

金胺“0”    1 g

石碳酸    50 mL

乙醇    100 mL

補蒸餾水至    1000 mL

b) 脫色劑:5%鹽酸乙醇(配制方法參照萋-尼氏染色);

c) 復染劑:0.5%高錳酸鉀水溶液。

12.3.5.2 涂片制備

同萋-尼氏抗酸染色法。

12.3.6 操作步驟

12.3.6.1 熒光染色

步驟如下:

a) 染色:涂片經火焰固定后,滴加金胺“0”染色劑蓋滿玻片,染色30 min,流水自玻片一端輕緩沖洗,洗去染色液,瀝去玻片上剩余的水;

b) 脫色:痰膜上端外緣滴加脫色劑,蓋滿玻片,脫色3 min或至無色,流水自玻片一端輕洗,洗去脫色劑;

c) 復染:加復染劑復染1min,瀝去復染液,流水自玻片一端輕洗,自然干燥后鏡檢。

12.3.6.2 顯微鏡檢查

有涂膜面向上放置玻片于熒光或LED顯微鏡載物臺,并以卡尺固定后,首先以10×目鏡、20×物鏡進行鏡檢,發現疑為分枝桿菌的熒光桿狀物質,使用40×物鏡確認。在暗背景下,分枝桿菌發出黃色熒光,呈桿狀略彎曲。

12.3.7 結果判讀

熒光染色鏡檢結果分級報告標準:

熒光染色分枝桿菌陰性(-):0條/50視野;

熒光染色分枝桿菌陽性(報告分枝桿菌數):1~9條/50視野;

熒光染色分枝桿菌陽性(1+):10~49條/50視野;

熒光染色分枝桿菌陽性(2+):1~9條/1視野;

熒光染色分枝桿菌陽性(3+):10~99條/1視野;

熒光染色分枝桿菌陽性(4+):100條及以上/1視野。

報告2+至少觀察50個視野,3+及以上的陽性結果至少觀察20個視野。

12.3.8 質量控制

痰涂片應保存近期3個月,年涂片量不足500張的實驗室痰涂片應保存1年,3月痰涂片量超過1000張的,保存近期1000張痰涂片,供上級結核病實驗室(或質量控制機構)進行質量控制復驗。

12.4 痰標本分枝桿菌固體培養基培養檢查

12.4.1 檢驗目的

分離臨床標本的分枝桿菌。

12.4.2 測定方法

目測法。

12.4.3 實驗原理

分枝桿菌因其較厚的細胞壁而具有耐受酸堿的特點,能耐受堿性消化液的處理,而酸性培養基能中和堿性標本處理液,堿消化液消化后標本可直接接種于酸性培養基上,用以分枝桿菌的分離培養。

12.4.4 標本要求

12.4.4.1 病人準備

不需要特殊準備。

12.4.4.2 標本類型

痰標本。

12.4.4.3 標本采集

具體步驟如下:

a) 當患者咳嗽咳痰時,易產生含有結核分枝桿菌的氣溶膠,感染周邊人群的機率較高,故采集痰標本時應在遠離人群的開放空間,或通風良好的留痰室內進行;

b) 深吸氣2次~3次,每次用力呼出,從肺部深處咳出,將打開蓋的痰盒靠近嘴邊收集痰液,擰緊    盒蓋;

c) 如果患者剛吃過東西,應先用清水漱口,裝有義齒的患者在留取痰標本之前應先將義齒取出;

d) 標本量:2 mL;

e) 不可接受樣本:唾液

f) 標本儲存與標本穩定性:  標本在2℃~8℃可保存5d。

12.4.5 設備和試劑

設備

二級生物安全柜、恒溫培養箱、渦旋振蕩器。

試劑

前處理管(50 mL離心管)、無菌吸管(每份標本需要2支吸管:1支前處理吸標本,1支接種)、試管架、斜面培養架、培養管架、廢液缸(注意:內盛不腐蝕高壓滅菌器的消毒液)、廢棄物袋。

4%氫氧化鈉(NaOH)溶液,酸性改良羅氏培養基。

12.4.6 操作程序

12.4.6.1 準備

具體準備如下:

a) 將酸性改良羅氏培養基從冷藏環境中取出,室溫下放置;

b) 接通生物安全柜電源,開風機保持預熱15 min;

c) 按照標本上的信息,將患者姓名或實驗序號標記在前處理管上;

d) 待酸性改良羅氏培養基恢復至室溫,在培養管斜面的背面標記患者姓名、實驗序號、接種日期。

12.4.6.2 標本處理

具體步驟如下:

a) 對照標記的患者姓名,在生物安全柜內使用無菌吸管吸取約2 mL標本于相應標記的前處理管中;

b) 旋緊痰標本容器螺旋蓋;

c) 視痰標本性狀,使用吸管,將1倍~2倍痰標本體積的4%NaOH加入前處理管中;

d) 旋緊處理管螺旋蓋,將前處理管置于試管架內;

e) 接通渦旋振蕩器電源,在生物安全柜內將前處理管在渦旋振蕩器上渦旋振蕩30 s左右至痰標本    液化;

f) 如果以手持拿前處理管,持拿方法是以拇指無名指分別持拿處理管外壁,食指、中指按處理    管螺旋蓋;

g) 將前處理管置于試管架內,置于生物安全柜內,室溫靜置15 min。

12.4.7 接種

具體步驟如下:

a) 擰開酸性改良羅氏培養管螺旋蓋,檢查培養基斜面底部的冷凝水,如果冷凝水過多,則沿著斜    面相對的一面的培養管內壁,將冷凝水棄去;

b) 以無菌吸管吸取前處理后的痰標本,吸取接近結束時,將吸管口移出液面,使吸管前端一段不    含液體,避免液體意外滴落;

c) 保持培養基斜面水平或底端略低,均勻接種至酸性改良羅氏培養基斜面上,每支培養基使用接    種2滴(0.1 mL~0.15 mL),接種時第一滴液體接種至斜面中部,第二滴接種到培養基上部;

d) 將用過的吸管置于生物安全柜內的廢液缸內;

e) 旋上培養管螺旋蓋,不要太緊;

f) 輕輕轉動并放低培養管底部,使接種的液體均勻的在斜面上鋪開;

g) 將培養基放置在斜面培養架上,保持培養基斜面水平向上;

h) 重復步驟a)~g),直至全部培養基接種完畢。

12.4.7.1 觀察報告

具體步驟如下:

a) 將接種后的培養基連同斜面培養架置于恒溫培養箱內,36℃土1℃孵育;

b) 24 h后,再擰緊培養管螺旋蓋,放置于直立的培養管架上,36℃土1℃條件下繼續孵育;

c) 接種后第3天和第7天觀察培養情況,此后每周觀察一次,直至第8周末。每次觀察后要在培養結果記錄本上記錄觀察結果。

12.4.8 結果判讀

結核桿菌的典型菌落形態為:不透明淡黃色、粗糙、干燥、凸起于培養基、有的成菜花樣。如果發現培養基液化、或者長霉菌,則報告污染。

分枝桿菌分級報告標準:

無菌落生長        報告培養陰

菌落生長不及斜面面積1/4時, 報告實際菌落數

菌落占斜面面積1/4    報告(1+)

菌落占斜面面積1/2    報告(2+)

菌落占斜面面積3/4    報告(3+)

菌落布滿培養基斜面    報告(4+)

12.4.9 質量控制

參照《分枝桿菌分離培養標準化操作程序及質量保證手冊》進行質量控制。

13 肺結核的流行病學

13.1 傳染源

開放性肺結核,特別是空洞性結核患者,痰中帶菌是結核病的重要傳染源

13.2 傳播途徑

傳播途徑主要是呼吸道。痰液干燥后,結核菌可隨灰塵漂浮空氣中。患者咳嗽或打噴嚏帶菌飛沫污染環境,皆可引起感染。結核菌經胃腸道傳播較少見,一般由于與病人共食,或飲用帶菌未經消毒牛乳而引起。結核菌不能通過健康皮膚,但經皮膚黏膜傷口可侵入人體

13.3 人群易感性

人群普遍易感,常隨年齡而增高,卡介苗接種有相對免疫效果。

13.4 流行特征

十九世紀結核病在全球流行猖獗,被稱為“白色瘟疫”。自1945年以后,多種抗結核藥物相繼問世,使全球結核病疫情逐漸下降,人類感到控制結核病有望。但是,80年代末至90年代初,全球結核病迅速回升,世界衛生組織指出,目前全球有17億人受到結核菌感染,占世界人口1/3,現有結核病人2000萬,每年約有900萬新發病例,有300萬人死于結核病,已超過艾滋病瘧疾腹瀉、熱帶病死亡的總和,成為傳染病中第一號殺手和最大的死亡疾病。面對如此嚴峻的形勢,1993年第46屆世界衛生大會發表了《全球結核病緊急狀態宣言》,呼吁采取迅速行動與結核病危機進行斗爭。目前我國結核病的流行情況也相當嚴峻,1990年全國抽樣調查,肺結核患病率為523/10萬,估計全國有傳染性肺結核病人約150萬。每年因結核病死亡接近23萬人。全國受結核菌感染人數約3.3億人。在結核患者中有34.7%是耐藥病人,給治療帶來困難。而且艾滋病在我國的傳播和人口大量流動等因素都給結核病控制帶來新問題。

14 參考資料

  1. ^ [1] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.WS 288—2017 肺結核診斷[Z].2017-11-9.

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  • 評論總管
    2018/4/27 8:57:01 | #0
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