化妝品中丙烯酰胺的檢測方法
2 1 范圍
本方法規定了采用液相色譜-串聯質譜法測定化妝品中丙烯酰胺單體（CAS：79-06-1）的方法。
本方法適用于化妝品中丙烯酰胺單體含量的測定。
3 2 方法提要
樣品經過提取后，用液相色譜-串聯質譜法測定，以多反應離子監測模式進行監測，采用特征離子豐度比進行定性，丙烯酰胺與內標峰面積比定量。本方法對丙烯酰胺的檢出限為0.00005 µg，定量下限為0.0002 µg；若取0.2 g樣品測定，本方法對丙烯酰胺的檢出濃度為0.005 mg/kg，最低定量濃度為0.025 mg/kg。
4 3 試劑
除另有規定外，所用試劑均為分析純，水為實驗室用一級水。
3.1 丙烯酰胺，純度 ≥ 99.0 %。
3.2 氘代丙烯酰胺（2,3,3-D3），純度 ≥ 98 %。
3.3 醋酸銨。
3.4 乙腈，色譜純。
3.5 甲醇，色譜純。
3.6 空白化妝品樣品：選擇不含丙烯酰胺的化妝品作為空白樣品。
3.7 乙腈溶液[φ（乙腈）= 10%]：量取10 mL乙腈（3.4）置100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。
3.8 醋酸銨溶液[c（醋酸銨）= 0.02 mol/L]：稱取醋酸銨0.08 g，置50 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得濃度約為0.02 mol/L的醋酸銨溶液。
3.9 丙烯酰胺標準儲備溶液[r（丙烯酰胺）= 0.5 g/L]： 稱取丙烯酰胺標準品（3.1）50 mg（精確到0.1 mg）置100 mL量瓶中，加乙腈溶液（3.7）使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.5 g/L的丙烯酰胺標準儲備溶液。
3.10丙烯酰胺系列標準溶液：按照表1操作，分別精密量取一定體積的丙烯酰胺標準儲備溶液（3.9）置10 mL量瓶中，以乙腈溶液（3.7）稀釋并定容至刻度，得不同濃度的丙烯酰胺系列標準溶液。
3.11內標工作溶液：稱取氘代丙烯酰胺標準品10 mg（精確到0.1 mg）置100 mL量瓶中，加乙腈溶液（3.7）使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為100 μg/mL的氘代丙烯酰胺儲備溶液，然后精密量取氘代丙烯酰胺儲備溶液1mL置50 mL量瓶中，加乙腈溶液（3.7）使溶解并定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為2 μg/mL的氘代丙烯酰胺內標工作溶液。
3.12 丙烯酰胺加入空白樣品標準溶液：取空白化妝品樣品6份，每份約0.20 g（精確至0.001 g）于5 mL塑料離心管中，分別加濃度為2 μg/mL的內標溶液50 μL，渦旋30 s，再分別加丙烯酰胺系列標準溶液50 μL，渦旋30 s；然后加0.15 mL 0.02 mol/L的醋酸銨水溶液，渦旋30 s。再加2.0 mL乙腈，渦旋60 s后，以10000 rpm離心轉速10 min，取上清液，氮氣吹干，殘渣加2 mL色譜流動相復溶，渦旋60 s，以10000 rpm轉速離心5 min，取上清液， 經0.45 μm微孔濾膜過濾后，濾液作為待測液，備用，使得每克樣品中含有丙烯酰胺0.025 μg、0.05 μg、0.25 μg、 1.25 μg、12. 5 μg、25 μg。
5 4 儀器
4.1 液相色譜-三重串聯四極桿質譜聯用儀。
4.2 分析天平：感量0.0001 g。
4.4 高速離心機。
4.5 精密移液器。
4.6 渦旋振蕩器。
6 5. 分析步驟
5.1 樣品預處理
稱取樣品0.20 g （精確至0.001 g），置5 mL塑料離心管中，加濃度為2 μg/mL的內標溶液50 μL， 渦旋30 s；然后加0.15 mL 0.02 mol/L的醋酸銨水溶液，渦旋30 s，再加2.0 mL乙腈，渦旋60 s后，以10000 rpm轉速離心10 min，取上清液，氮氣吹干，殘渣加2 mL色譜流動相復溶，渦旋60 s，以10000 rpm轉速離心5 min，經0.45 μm微孔濾膜過濾后，濾液作為待測液，備用。
5.2 液相色譜-三重串聯四極桿質譜聯用分析條件
5.2.1 色譜參考條件
色譜柱：Waters Atlantis T3（3.5 μm, 2.1 × 100 mm）或具有同等柱效的色譜柱；
流動相：甲醇+0.1%甲酸水溶液 = 1.5+98.5，恒度洗脫3 min；
流速：0.3 mL/min；
柱溫：25 ℃；
進樣量：5 μL。
5.2.2 質譜參考條件
離子源： 電噴霧離子源（ESI源）；
監測模式： 正離子監測模式； 監測離子對及相關電壓參數設定見表2；
霧化氣壓力： 50 psi；
干燥氣流速： 12 L/min；
干燥氣溫度： 350 ℃；
毛細管電壓： 4000 V；
0 - 1 min：不進入質譜儀分析, 1 - 2.5 min：進入質譜儀分析。
5.3 定性判定
用液相色譜-串聯質譜法對樣品進行定性判定，如果檢出的色譜峰的保留時間與標準品相一致，并且所選擇的監測離子對的相對豐度比與標準樣品的離子對相對豐度比相一致（見表3），則可以判斷樣品中存在丙烯酰胺。
5.4 定量測定
在“5.2”項液相色譜-三重四極桿質譜聯用分析條件下，用丙烯酰胺加入空白樣品的系列濃度的標準溶液（3.12）分別進樣，以丙烯酰胺加入空白樣品的系列濃度為橫坐標，丙烯酰胺與內標的峰面積比為縱坐標，進行線性回歸，建立標準曲線，其線性相關系數應 > 0.99。取“5.1”項下處理得到的樣品待測溶液進樣5 μL，將丙烯酰胺與內標的峰面積比代入標準曲線，計算丙烯酰胺的質量濃度，按“6 計算”，計算樣品中丙烯酰胺的含量。
5.5 平行實驗
按以上步驟操作，對同一樣品獨立進行測定獲得的兩次獨立測試結果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。
7 6 計算
式中：w（丙烯酰胺）——化妝品中丙烯酰胺的含量，mg/kg；
m ——樣品取樣量，g；
m1 ——代入回歸方程計算得到的樣品待測溶液中丙烯酰胺的質量，mg；
8 7 回收率和精密度
兩個濃度水平的平均提取回收率在85 - 110%，并且RSD小于8％（n=6），平均方法回收率在96.6 – 106％之間，并且RSD小于8％（n=6）。
表1 丙烯酰胺系列標準溶液的配制
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工作溶液 |
溶液初始濃度 |
量取體積 |
定容終體積 |
標準溶液終濃度 |
|
標準溶液1 |
（0.5 mg/mL） |
2 mL |
10 mL |
100 μg/mL |
|
標準溶液2 |
（0.5 mg/mL） |
1 mL |
10 mL |
50 μg/mL |
|
標準溶液3 |
（50 μg/mL） |
1 mL |
10 mL |
5μg/mL |
|
標準溶液4 |
（5μg/mL） |
2 mL |
10mL |
1 μg/mL |
|
標準溶液5 |
（1 μg/mL） |
2 mL |
10 mL |
0.2 μg/mL |
|
標準溶液6 |
（1 μg/mL） |
1 mL |
10 mL |
0.1 μg/mL |
表2 三重四級桿離子對及相關電壓參數設定表
|
編號 |
物質名稱 |
母離子（m/z） |
Frag.(V) |
子離子（m/z） |
CE（V） |
|
1 |
丙烯酰胺 |
72 |
40 |
55 |
8 |
|
2 |
氘代丙烯酰胺（內標） |
75 |
40 |
58 |
8 |
表3 監測離子和離子相對豐度比
|
監測離子對（m/z） |
離子相對豐度比（%） |
允許相對偏差（%） |
|
72-55 |
100 |
|
|
72-44 |
應用標準品測定離子相對豐度比 |
±50 |
|
72-27 |
應用標準品測定離子相對豐度比 |
±50 |
9 8 色譜圖
丙烯酰胺和內標標準溶液的多反應離子監測的高效液相質譜色譜圖
色譜峰：丙烯酰胺（TR=1.7 min），內標（TR=1.7 min）
