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肝纖維化

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1 拼音

gān xiān wéi huà

2 概述

肝纖維化是指肝臟纖維結締組織的過度沉積,是纖維增生和纖維分解平衡的結果。纖維增生是機體對于損傷的一種修復反應,各種病因所致反復或持續的慢性肝實質炎癥壞死可導致肝臟持續不斷的纖維增生而形成肝纖維化,從許多慢性肝病,特別是慢性病毒性肝炎的臨床及病理演變來看,肝纖維化和肝硬化是連續的發展過程,二者難以截然分開。

3 治療措施

抗纖維化的治療旨在減輕纖維化的程度、延緩其發展,乃至逆轉其病理進程。為此抗纖維化的治療應包括:①針對致病因子,治療原發病。如抗肝炎病毒,治療血吸蟲病,防治酒精中毒等;②對抗肝纖維化發生發展的治療;③如已發展至肝硬化,則需對其合并癥進行防治;④對癥及恢復肝功能的治療 。

肝纖維化是多種病因發展為肝硬化的共同病理基礎,近年來,隨著對肝纖維化機制的深入了解,特別是ECM的合成與降解的分子生物學的深入了解,許多研究工作設想在ECM代謝,尤其膠原合成與降解各環節上采取治療措施,現將其中主要的分述于下。

一、抑制膠原合成

1.干擾素

γ-干擾素能抑制貯脂細胞的激活、增殖、降低α-Actin,Ⅰ、Ⅳ型膠原及纖維連結蛋白的mRNA穩態水平,國外有臨床報道小劑量應用副作用輕微,治療肝纖維化可能有效。α-干擾素有抗病毒作用,且能使慢性丙肝患者組織中Ⅰ型膠原mRNA及TGF-βmRNA降低,肝纖維化減輕,但在另一方面,γ-干擾素又能啟動巨噬細胞生成IL-1、TNF-α,后兩者能刺激貯脂細胞的DNA合成與增殖。它可能不利于肝纖維化。這兩方面作用的凈效應如何,尚需進一步觀察。

2.腎上腺皮質激素

實驗上見到,它在細胞培養及整體動物中抑制Ⅰ型膠原mRNA的表達,使肝細胞及成纖維細胞內Ⅰ型膠原mRNA水平降低,從而抑制膠原的合成。但因長期應用全身副作用較多,很少用于抗肝纖維化治療。治療自身免疫性慢性肝炎,雖可致臨床緩解,但并不能阻止纖維化的形成。

3.前列腺素類似物

前列腺素有廣泛的生物活性。已知在膽堿缺乏性大鼠,16,16-Dimethy1 Prostanglandin E2(DEMG)能減少纖維化及脂肪沉積,機制可能是抑制肝內Ⅰ型膠原mRNA的表達。又有工作說明它可增加細胞內cAMPR從而增加細胞內降解。同時能增加肝血流、改變膜流動性,改變血中胰島素胰高血糖素的水平。抑制巨噬細胞釋放炎性因子。但目前尚未用于人的肝纖維化。

4.類視黃醇類物質(Retinoids)

此類藥物反式維甲酸(Trans-retinoic Acid)和順序式維甲酸(B-cis-retinoic Acid),減少Ⅰ型膠原及其mRNA的合成,減少單核細胞分泌膠原酶,但因它又是Ito細胞內含物,故有增加Ⅰ型或Ⅲ型膠原的可能,不見得宜于治療肝纖維化。

5.前膠原肽

已知前膠原兩端肽(非球形伸展部)可由特殊的肽酶所切斷,切下來的肽,如氨基礎肽(即PⅢP)可反饋地抑制前膠原合成。在正式應用之前,尚需進行詳盡的分子生物學研究,目前無有關用它治療的報道。

二、作用于前膠原mRNA轉譯后的環節

1.秋水仙堿(Colchicine)

此藥曾在國內外試用于臨床。實驗研究提示:秋水仙堿是抗微管藥物,抑制微管蛋白聚合,從而干擾細胞的膠原分泌。它還能刺激膠原酶的活性,增強降解,又能作用于巨噬細胞,抑制單核細胞因子,抑制生長因子的釋放,減少白細胞介素Ⅰ的分泌。Kershenobich和Rojkind等對秋水仙堿治療肝硬化做了多年的觀察。他們采取了隨機、雙盲、安慰劑對照的方法。在14年中隨訪觀察了100例肝硬化患者(54例為酒精性,41例為肝炎性,14例為其他原因所致)。觀察結果表明,中位存活時間治療組為11年,安慰劑組為3.5年(P=0.0006)。10年累積生存率分別為56%和20%(P=0.0006)。治療組30例,曾作連續肝活檢,其中9例有組織學的好轉,而安慰劑組14例做了連續肝活檢,無1例好轉(P=0.002),此一研究提示秋水仙堿對延長存活率有一定作用。但其他一些臨床研究不能證實這一結果,如曾有人(1987,1988)用秋水仙堿治療原發性膽汁性逐步形成硬化,見其未能阻止肝纖維化的進展。Wang Y.C.(1994)曾用雙盲隨機對照的方法治療乙型肝炎肝硬化100例,與對照組相比較,無論肝組織學改變、血清纖維化指標、病情發展以及病死率等方面,秋水仙堿組均未見療效。看來本品在抗纖維化治療上希望不大。

2.脯氨酸-4-羥化酶抑制物

驗證明它能抑制脯氨酸的羥化,減少羥脯氨酸的形成,因而減少前膠原三股螺旋α肽鏈的穩定性。曾有兩個吡啶化合營企業物,Pyridine 2,4-dicarboxylate(2,4-PDCA)和Pyridine2,5-dicarboxylate,于動物實驗有抗肝纖維化的效果,但因副作用已中止臨床試驗。

3.金屬離子絡合劑

雙吡啶(αα'-dipyridy1)能絡合鐵離子而抑制脯氨酸羥化酶的活性,使新合成的膠原α-肽鏈因羥化受抑不能形成三股螺旋而在細胞內被釋放;最近又發現它能降低Ⅰ型膠原mRNA的穩定性從而使膠原合成減少。其抗纖維化作用尚待進一步研究證實。D-青化酶胺是銅離子絡合劑,而銅離子是賴胺酰氧化酶的重要輔助因子,故本藥能抑制該酶的活性,使新分泌出來的膠原不能相互交聯;它對肝豆狀核變性有較好的療效,但對其他原因所致的人類及動物肝纖維化無明顯療效,且長期應用副作用較大。

4.脯氨酸類似物(Proline Analogs)

此類化合物有吖丁啶(Azetidine Carboxylicacid),順-4-羥基脯氨酸等,它可取代脯氨酸而結合到前膠原中,形成非螺旋膠原。這種膠原易為蛋白酶水解,以致細胞外基質的形成減少。目前僅在大鼠體內作過實驗見到減少膠原的效果。其毒性較大,也尚未試用于人。

5.前膠原向膠原轉化的抑制物

其基本作用為阻止切斷前膠原分子兩端的肽,以致不能形成膠原分子,且使膠原穩定性受損,首先試用的是精氨酸及其類似物(Convanine),尚未用于動物實驗及人體治療。

6.山黧豆素(Lathyrogen)

其中含β-氨基丙腈及氨基乙腈,能抑制賴氨酰氧化酶的活性,阻止膠原纖維的架橋連結,對肝纖維化目前僅限于實驗研究,尚未用于人的肝纖維化。

三、促進膠原降解的治療

目前對促進膠原酶活性藥物的研究僅處于起步階段。但本類藥物的臨床意義重大,因為促進過度沉積之膠原的降解就有可能逆轉已經形成的肝纖維化。Lieber C.S等報道不飽和卵磷脂(PUL)能減輕狒狒的酒精性肝硬化,進一步經體外細胞培養研究發現它對Ⅰ型前膠原mRNA的表達無影響,但能使貯脂細胞的膠原酶活性升高一倍。這提示促進降解活性可能是PUL治療狒狒酒精性肝纖維化的作用機制。目前正在進行多中心的臨床實驗。

四、基因治療

Wu CH等報道,用反義寡核苷酸(ASO)DNA,以乏涎粘蛋白賴氨酸(AsORPL)為載體,導向作用于3-T-AsGR細胞,見到ASOE及ASOC能分別抑制Ⅰ型前膠原mRNA的73%及67%。這一工作為基因治療抗肝纖維休開闊了前景。

從上述看來,盡管在膠原代謝各項環節均有治療的實驗性研究,但確立一個有效而副作用少的治療藥物尚須長期努力。

五、中醫中藥的治療

新中國建立以來,應用祖國醫學治療慢性肝病有了很大發展,其中與抗纖維化或治療肝硬化有關的實驗與臨床研究有:強肝軟堅湯(韓經寰,1979),葫蘆素B、齊墩果酸(韓德五,1979、1981)、甘草甜素甘草次酸(趙敏琦等,1983)、丹參等藥(王楨苓等,1982)、蟲草菌絲、丹參(馬學惠等,1988)、桃仁冬蟲夏草(王玉潤、劉平、劉成、1985,1991)、田三七(肖家誠,1988)、復方丹參合劑王寶恩等,1990)、血腑逐瘀湯(宋家武,李紹白,1991)、復肝康沖劑(楊正云等,1990)、補腎益精、益氣養陰清熱解毒諸方(范宗滂等,1991)、蟲草菌絲(張立煌等,1992)、軟肝沖劑(李延福,1992)等。近年研究表明:病理證實的輕度慢性肝炎中62.6%有肝纖維化,中度、重度慢性肝炎及肝硬化則100%有肝纖維化,因而中醫中藥治療肝纖維化,當從慢性肝炎及肝硬化的整體辨證入手,以病機為基礎,制定理、法、方、藥。

在祖國醫學文獻中本無慢性肝炎及肝硬化之病名,而是包括在“黃疸”、“脅痛”、“淤血”、“癥積”和“臌脹”諸病證之中。近代中醫的研究認為慢性肝炎及早期肝硬化系因濕熱之邪未清,纏綿日久,傷及臟腑氣血。因邪伏血分正氣虧損而肝氣郁結,血淤血滯。正氣不行,痰濁膠結加之氣虛血淤則促成癥積。肝病既久,乘脾犯胃,升降失司,氣機衰微,又加重血虛氣虛。進而病久及腎,導致肝腎陰虛脾腎陽虛。以致肝、脾、腎俱損,氣、血、水搏結。有的中醫專家指出:總結病機之中心環節:氣虛血滯為肝硬化之本,濕毒熱邪留血分為標,肝無血養而失柔,腎無清填而失潤。治則要以活血益氣、養血柔肝為基礎,兼及滋補肝腎溫補脾腎,如余邪未清,佐以祛邪。

基于上述,近年對慢性肝炎及早期肝硬化之中醫治療多以活血化淤的法則為主,兼以益氣補虛、養血柔肝或滋補肝腎。

馬學惠、韓德五等經系列實驗研究表明丹參對動物實驗性急性肝損傷有減輕肝細胞變性、壞死,降低谷丙轉氨酶,降脂及增加肝糖原的作用。對肝部分切除動物可促進肝細胞再生。對實驗性肝纖維化能防止肝硬化發生并有促進肝內膠原重吸收的作用,又見對實驗性急性肝衰竭有防治作用。其機制可能是減輕內源性內毒素血癥,增強Kupffer細胞的功能;防止自由基的產生,減輕脂質過氧化;穩定肝細胞膜細胞器膜;增加肝臟藥酶及防止Ca++內流等。在實驗性肝纖維化、肝硬化觀察到丹參能降低血清透明質酸水平,減少動物肝內膠原蛋白含量及Fn、Ln的產生。

王玉潤、劉平、劉成等用桃仁提取物合并蟲草菌絲治療血吸蟲病肝纖維化,以PⅢP、血、尿羥脯氨酸、肝組織膠原酶等作為觀察指標,結果表明在病原(即血吸蟲)得到治療后,本治療對肝纖維化患者肝內膠原分解代謝有一定促進作用

本章作用王寶恩等以丹參為主的活血化淤中藥復方對實驗性肝纖維化進行觀察治療。見活血化瘀中藥對CCL4中毒性損傷以及白蛋白免疫損傷性肝纖維化均有防治效果,應用此藥可不同程度地減輕肝纖維化的發展,也可使已形成肝硬化者纖維化明顯逆轉。病理組織學觀察表明活血化淤復方能抑制纖維結締組織中Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原的增生和沉積,阻止其沿小葉間及向小葉內延伸。與此同時,實驗室研究還觀察到,此活血化淤復方不論預防性用藥或治療性用藥均有明顯提高肝纖維化大鼠肝組織及血清膠原酶活性的作用,并可提高肝組織中活性膠原酶與潛在膠原酶的活性的比值。說明降解活性的增高為活血化淤中藥抗纖維化機制的又一重要方面。至于此中藥復方的作用部位,經分子生物學研究,因其能抑制肝組織Ⅱ、Ⅲ型膠原mRNA的表達,在體外能抑制培養的貯脂細胞Ⅳ型膠原mRNA的表達。說明中藥作用部位在于膠原基因轉錄水平。于慢性肝炎及肝硬化患者臨床應用,也有較好效果。表現在治療后癥狀消失或減輕、脾臟縮小,門脈直徑增寬減輕。轉氨酶升高者73%恢復正常。血清PⅢP、Ln含量由增高回降到正常。提示本方是一抗纖維化的有效方劑

除活血化淤法則以外,也有其他法則治療有效的實驗研究,如用補腎益精、益氣養陰及清熱解毒等法則的中藥對大鼠肝纖維化均有程度不等的治療作用。

從國內大量工作看來,中醫中藥治療肝纖維化有很大潛力,應予以重視。

4 病因學

肝纖維化的發生機制

肝臟貯脂細胞是產生各種細胞外基質的主要來源。在肝臟纖維化的發生和發展過程中貯脂細胞激活轉化為肌成纖維細胞樣細胞(Myofibrblast-like cells)和成纖維細胞(Fibroblast),因而貯脂細胞的激活過程已成為肝纖維化發生機制研究的焦點之一。調節貯脂細胞的因子可分為不溶性和可溶性兩類,前者為各種細胞外基質,后者包括各種生長因子、細胞因子

正常肝臟血竇內皮下的功能性基底膜(Ⅳ型膠原和層連蛋白)對于維持貯脂細胞的靜止狀態(貯存Vit. A,分泌Ⅳ型膠原)起重要作用,一旦基底膜遭到破壞,貯脂細胞的表型即可發生改變。

調節貯脂細胞的細胞因子和生長因子很多。能夠促進其增殖的有PDGF,EGF,IGF-1,FGF-2,TGF-α;能抑制其增殖的有視黃醇和維甲酸及內皮素;TGF-β本身對貯脂細胞的生長有抑制作用,但通過刺激PDGF和FGF-2的表達又可促進其生長。在這些細胞因子中以TGF-β1和PDGF研究得較為深入。在肝臟中TGF-β1主要由貯脂細胞、Kupffer細胞、內皮細胞、血小板及肝細胞產生,通過旁分泌對其他細胞發生調節作用。TGF-β1可促進貯脂細胞表達和分泌Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原、纖維連接蛋白、細胞粘合素、軟骨連接蛋白、血栓粘合素、Biglycan及Decrin。而且還可通過自分泌作用促進TGF-β1自身的表達,它對金屬基質蛋白酶(膠原酶、基質分解素)和纖溶酶原激活物的表達有抑制作用,而且可促進內皮細胞和貯脂細胞表達纖溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)。因此,TGF-β1是目前發現的最重要的致纖維化細胞因子。PDGF可由多種細胞產生。是一種很強的致有絲分裂原,通過α和β型受體對貯脂細胞的增殖有促進作用,而且TGF-β1可加強這一作用;它本身對細胞外基質的表達無明顯影響。TNF-γ是由淋巴細胞產生的,它對貯脂細胞的激活、生長和膠原分泌有抑制作用。在肝臟ET-1主要由血竇內皮細胞和激活的貯脂細胞產生。貯脂細胞表達高水平的ET-1受體,通過旁分泌和自分泌作用引起激活的貯脂細胞和膠原纖維束的收縮,從而導致血竇的血流改變和肝小葉結構扭曲。貯脂細胞激活的三階段假學。

一、炎癥前階段(Preinflammatory  Phase)

當肝實質受損傷時,細胞膜通透性增加,釋放出“損傷激素”(Wound Hormone),通過旁分泌作用激活貯脂細胞。體外實驗表明,大鼠肝細胞可釋放促進貯脂細胞增殖的細胞因子-肝細胞性Ito細胞啟動因子(Hepitoin,Hepatocellular Ito Cell Initiator)。同時肝臟間質的損傷如果破壞了血竇內皮下的功能基底膜,亦可促進貯脂細胞的表型改變而使其激活。

二、炎癥階段(Inflammatory Phase)

由于肝實質損傷,Kupffer細胞和單核巨噬細胞、淋巴細胞、血小板被激活而釋放出各種的炎癥性介質和細胞因子,如急性期蛋白(IL-1,IL-6,TNF-α)和TGF-1,EGF,PDGF,TGF-α,TGF-β等。這些因子也是通過旁分泌途徑促進貯脂細胞的增殖及纖維增生。此階段貯脂細胞受Kupffer細胞分泌的某種細胞因子誘導而表達出PDGF受體,對PDGF發生反應而增殖活化為肌成纖維細胞樣細胞。TGF-β不僅能增加PDGF對貯脂細胞的增殖作用,而且能促進其表達和分泌各種細胞外基質并抑制其降解。

三、炎癥后階段(Postinflammatory Phase)

在上述兩個階段經旁分泌途徑激活的貯脂細胞表達大量的TGF-α,TGF-β,FGF及其受體,通過自分泌作用不斷刺激自身的分裂增殖并大量合成和分泌膠原等各種細胞外基質。同時還可通過旁分泌作用激活其他尚處于“靜止”狀態的貯脂細胞。這一機制可解釋即使原發的刺激因素解除,肝纖維化過程仍能繼續發展的現象。

在上述各個階段中基質降解酶的作用可歸納為:貯脂細胞分泌的Ⅳ型膠原酶破壞正常的血竇內皮下功能性基底膜,促進其增殖和活化;TGF-β抑制間質性膠原酶的活性,刺激TIMP的活性,因而促進細胞外基質的沉積。

5 病理改變

肝纖維化(Fibrosis)是指肝臟纖維結締組織的過度沉積,是纖維增生( Fibrogenesis,即細胞外基質合成增加)和纖維分解(Fibrolysis,即細胞外基質降解)不平衡的結果。纖維增生是機體對于損傷的一種修復反應,一旦有害因素去除、細胞外基質成分得到恢復則纖維增生停止。所以急性或一過性肝臟疾患即使很嚴重也不會導致肝纖維化。但各種病因所致反復或持續的慢性肝實質炎癥、壞死可導致肝臟持續不斷的纖維增生而形成肝纖維化,向前發展發生肝小葉結構的破壞及結節形成即成為肝硬化。從肝硬化的病理學的定義來看,僅有彌漫性肝纖維化而無結節形成(如先天性肝纖維化心力衰竭所致的肝腺泡第三區纖維化)不能稱為肝硬化;僅有結節形成而無彌漫性肝纖維化(如局灶性結節性肝細胞增生,結節性肝細胞再生性增生)也不是肝硬化。但是從許多慢性肝病,特別是慢性病毒性肝炎的臨床及病理演變來看,肝纖維化和肝硬化是連續的發展過程,二者難以截然分開。近年來隨著細胞生物學和分子生物學的迅速發展,人們對肝臟細胞外基質的組成、代謝及其生物學功能的認識不斷深入,因而對肝纖維化的發生機理、診斷和治療的研究也有了較大的進展。

一.細胞外基質(Extracellular Matrix,ECM)的組成及其代謝和生物學功能

細胞外基質一般包括膠原、非膠原糖蛋白、蛋白多糖及彈性硬蛋白。按照最新的觀點,ECM還應包括間質金屬蛋白酶(MMP),金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP),基質粘附分子(即細胞外基質受體),以及與間質成分大分子結合的各種生長因子和細胞因子。現在認為ECM不是雜亂無章、僅起支架作用的靜態物質,而是組織有序、代謝活躍,且對細胞、組織和器官形態、生長、分化和代謝等結構和功能有重要影響的生命分子。

(一)膠原(Collagen)

膠原是細胞外基質的最重要成分,目前已發現至少19型基因序列不同的膠原。在肝臟總含量較高的有5型,分別為Ⅰ型33%,Ⅲ型33%,Ⅳ型1%,Ⅴ型1%~10%,Ⅵ型0.1%~1%。正常人肝臟的膠原含量約為5.5mg/g肝濕重,Ⅰ/Ⅲ型膠原的比為1:1;肝纖維化和肝硬化時肝臟膠原含量可增加數倍,且Ⅰ/Ⅲ型的比值增加,到后期此比例可增至2.38。根據膠原的形態和結構特點及分布部位,可分為兩大類:①纖維性膠原:包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型,Ⅴ型膠原:去除C端肽后分布于血竇周圍和門脈區,作為核心使Ⅰ、Ⅲ型膠原形成粗大的纖維。Ⅵ型膠原呈串珠樣結構分布于Ⅰ、Ⅲ和Ⅴ型膠原形成的纖維束之間起粘附作用。②基底膜性膠原:即Ⅳ型膠原,它的端肽不去除而是借此相連形成三維網格狀結構,主要分布于肝血竇內皮下,為肝細胞和內皮細胞功能基底膜的主要成份。膠原的合成步驟包括基因轉錄、翻譯、翻譯后修飾(羥基化和糖基化)形成α肽鏈,三條α鏈形成三螺旋即膠原的基本單位-前膠原(Precollagen),經微管排泌到細胞外切去N端和C端肽后相互交聯形成膠原纖維或網格狀結構。

(二)非膠原糖蛋白(Noncollagenous Glycoproteins)

是細胞外基質的另一重要組分,其分子中的多個功能區可與其他細胞外基質及多種細胞膜的跨膜蛋白受體結合,從而影響細胞的生長、分化、代謝等各種生物學行為。其種類很多,現擇要列舉如下:

1.纖維連結蛋白質(Fibrnectin)

可分為血漿性(可溶性)和細胞性(不溶性),前者主要由肝細胞產生,后者主要由貯脂細胞、巨噬細胞及血管內皮細胞產生。在肝纖維化早期其含量增多,作為以后膠原沉積的支架。

2.層連蛋白(Laminin)

是由三個亞單位(一條α鏈和兩鏈β鏈)組成的“十”字型結構,其分子內部有可與細胞表面受體和肝素結合的功能區。它和Ⅳ型膠原一起構成基底膜的主要成份,分布于血管、膽管基底膜上,肝血竇內皮下亦有少量分布,這對于維持細胞的分化狀態有重要意義。

3.細胞粘合素(Tenascins,Cytotactin,Bronionectin,Hexabronchions)

是由6個相同的亞單位組成的六聚體,由貯脂細胞產生。肝纖維化是沉積于細胞損傷嚴重的區域,如中央靜脈周圍和細的纖維間隔中,可能在早期ECM的沉積中起作用。

4.粗纖維調節素(Undulin)

由3個亞基組成,其單體和層連蛋白相似,但少一個短臂,主要分別于緊密排列的Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維中,它對維持膠原的超分子結構起重要作用,其細胞來源尚不明了。

5.血栓粘合素(Thrombospondin)

由3個相同亞基的末端在中央形成一個小球體,能結合肝素、Ⅴ型膠原、纖維連結蛋白、血漿纖溶酶原和纖維蛋白原。其功能是防止細胞擴散

6.副纖維連接蛋白(Vitronection,VN)

由肝細胞產生,其分布與纖維連接蛋白相似,具有結合膠原的功能。肝硬化時分布于膠原纖維沉積的部位。血漿VN水平和肝纖維化程度有一定的相關性。

7.副層連蛋白(Entactin,Nidogen)

呈不對稱啞鈴形,它可與層連接蛋白中心部位特異性共價鍵結合,從而調節后者與其受體的結合。其分布和層連蛋白的單位相似,主要分布于基底膜。

(三)蛋白多糖(Proteoglycan)

蛋白多糖是一類由蛋白質作核心骨架,在N或O位上連有糖胺多糖(

Glycosaminoglycan,GAG)側鏈的大分子物質,它們與膠原一起分布于細胞外基質和基底膜上,同時也分布于細胞膜上。其糖胺多糖可分為硫酸乙酰肝素(Heparan  Sulfate)、硫酸皮膚素(Dermatan Sulfate)、硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate)及硫酸角質素(Keratan Sulfate)。正常肝臟中硫酸乙酰肝素含量最多,占肝臟總GAG的60%;肝纖維化時其含量下降,而硫酸皮膚素和硫酸軟骨素的含量增加。透明質酸(Hyaluronic Acid)是一特殊的多糖,未經硫化亦不含蛋白骨架。近年已將許多蛋白多糖核心蛋白的cDNA克隆出來,對其生物學功能的了解也日趨深入。根據其分布不同大體可將蛋白多糖分為兩類:

1.與細胞膜相關的蛋白多糖

其核心蛋白多有跨膜功能區,有的也可經其GAG側鏈與細胞膜相連。它們含有大量的硫酸乙酰肝素和少量的硫酸軟素,可與細胞外基質、生長因子、細胞粘附分子(CAM)及蛋白酶抑制物結合,使這些物質的活性增強或減弱。

Syndecan產生于肝組織和培養中的肝細胞(Hepatocyte),是一些細胞間質的受體,可通過其GAG側鏈與Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原,纖維連結蛋白及細胞粘合素相結合。同時還是bFGF的輔助受體(Coreceptor)。其主要功能是信號傳遞

Thrombomodulin由血管內皮細胞產生,其GAG側鏈為硫酸軟骨素。可與凝血酶結合,抑制纖維蛋白原和因子Ⅴ的激活,從而調節血液凝固過程。

Betaglycan其GAG側鏈為硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素。是細胞膜受體,對TGF-β有高親和力,是它的Ⅲ型受體。

2.與細胞外基質相關的蛋白多糖

它們主要分布于細胞外基質中。

Fibromodulin其GAG側鏈為硫酸角質素,可以調節膠原微纖維的形成。在肝臟中尚未發現。

Perlecan由非實質細胞產生,分布于基底膜和膽管、血管。可與內皮細胞和肝細胞結合。

Decorin其 GAG側鏈為硫酸軟骨素和硫酸皮膚素。可與Ⅰ、Ⅳ膠原、纖維連結蛋白結合,延緩膠原微纖維的形成。TGF-β可使Decorin的表達增加,而Decorin可使TGF-β滅活。在富含維甲酸的貯脂細胞中Decorin表達較高,因而可抑制TGF-β的活性;而在失去維甲酸的貯脂細胞中,Decorin的表達減少,因而對TGF-β的抑制減弱。

Biglycan其GAG側鏈為硫酸軟骨素和硫酸皮膚素,由貯脂細胞和肌成纖維細胞產生。通過其核心蛋白與TGF-β結合,通過其GAG與bGFG結合。TGF-β可使其表達增高,而維甲酸可使其表達減低。

Versican其側鏈為硫酸軟骨素,PDGF和TGF-β可使其表達增加。可與透明質酸結合。尚未確定肝臟細胞是否可產生Versican。

(四)細胞-間質粘附分子(Cell-Matrix Adhension  Molecules)

細胞和細胞外基質成份之間的分子相互作用是通過特定的質膜蛋白即各種粘附分子來實現的。一些在其他上皮細胞和內皮細胞上經常表達的粘附分子,在正常肝細胞和血竇內皮細胞中不表達,但在纖維化的發生過程中這些粘附分子的表達呈上調(Upregulation)改變。細胞一間質粘附分子主要包括Integrin家庭和CD44蛋白家庭。

1.Integrin

是由α和β鏈非共價格結合組成的二聚體,現已知有17種α鏈和8種β鏈共組成21種有功能的二聚體。作為受體Integrin可以結合多種配體,而一種細胞外基質成分可由多種Integrin通過不同的識別位點結合。最重要的識別位點是細胞外基質分子中的R-G-D(精-甘-天)序列,大多數Integrin受體皆可識別之。各種Integrin有其特定的組織分布,一種細胞可以存在多種Integrin,其配體識別位點亦可有重疊。在非極性細胞上,Integrin分布于各個面,在極性細胞只分布于其底面和側面。它們不僅起粘附作用,而且因其細胞內功能區與細胞骨架相連,故可以傳遞信號,促進細胞的增殖、分化和移行。根據β鏈可將Integrin分為3個亞族:

β1(10種)、β3(2種)、β4(1種)其主要功能是介導細胞與間質的粘附,分布于大多數體細胞。可與膠原和非膠原糖蛋白結合,尚未發現它們與蛋白多糖結合。

β2(3種)、β7(2種)主要表達與白細胞介導免疫系統內細胞與細胞之間的相互作用。

β6(1種)、β7(1種)、β8(1種)其分布范圍局限,功能尚不清楚。

2.CD44蛋白家族

是一類大量糖基化的跨膜蛋白,廣泛分布于體細胞,可以介導細胞-細胞,細胞-間質的相互作用。本家族的成員亦很多,在正常狀態下,肝細胞內檢測不到CD44蛋白的表達,但在血竇內皮細胞中可有表達。

粘附分子在肝纖維化過程中最顯著的改變是肝細胞和血竇內皮細胞誘導表達Integrin家族中的層連蛋白受體,而且其表達上調改變早于肝硬化的形成。致纖維化的細胞因子如TGF-β和促進炎癥的細胞因子如TGF-α、IL-1β、IFN-γ均可促進Integrin受體和CD44蛋白的高表達。不管其基礎疾病如何,Integrin受體的誘導表達情形相似,提示這是一種對細胞相鄰細胞外基質成分改變的非特異性反應。Integrin受體的激活可以直接和間接地觸發一系列的細胞內事件,如細胞的形態、生化、代謝、分泌、胞漿底物的酪氨酸磷酸化等,提示細胞外基質對于調節肝細胞和血竇內皮細胞的結構和功能起重要作用。在肝纖維化的早期,Integrin受體的表達可能促進細胞外基質在局部的沉積和組織,因而這種細胞-間質粘附分子的表達上調作用不僅是對細胞微環境改變的適應性反應,而且很可能在啟動纖維化本身的過程中起主動的作用。

(五)基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMP)

細胞外基質主要被MMP所降解,到目前為止已發現了9種MMP,按其作用底物的不同可分為膠原酶、明膠酶、基質分解素3大組,其底物特異性和細胞來源見表。

表 基質金屬蛋白酶的底物特異性和細胞來源

命名 肝臟中細胞來源 作用底物特異性
膠原酶   Ⅲ>Ⅰ,Ⅱ,Ⅷ,Ⅹ
間質性膠原酶 貯脂細胞 Ⅰ>Ⅲ
中性粒細胞膠原酶  
明膠酶/Ⅳ性膠原酶    
明膠酶A/Ⅳ性膠原酶(72KD) 貯脂細胞 Ⅳ,?Ⅴ,Ⅸ,明膠
明膠酶B/Ⅳ性膠原酶(92KD) Kuppfer細胞 Ⅳ,Ⅴ,明膠,?Ⅲ
基質分解素    
基質分解素-1 貯脂細胞 Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ,Ⅸ,LN,蛋白多糖,LN,酪蛋白同上
基質分解素-2 同上
基質分解素-3 尚不清楚
基質分解素(Matrilysin) Ⅳ,蛋白多糖,FN,明膠,彈性硬蛋白
其他    
金屬彈性酶(Metalloelastase) 彈性硬蛋白,Fn

這些基質金屬蛋白酶都屬于一個基因家族,它們的結構中有數個氨基酸序列高度保守的共同功能區,例如它們都有對于維持酶原潛伏性的前肽功能區(含PRCGVPDV序列),120個氨基酸的N端功能區以及催化位點的鋅結合功能區(含HELGH序列),基質金屬蛋白酶的調節可發生在基因轉錄調控、無活性酶原的激活及組織抑制物對已被激活酶的抑制三個水平上。

一些生長因子、細胞因子和維甲酸共同調控多種基質金屬蛋白酶的表達,有些則特異地對某種基質金屬蛋白酶的表達有調控作用。

基質金屬蛋白酶是以無活性的酶原形式分泌出來的,必須在細胞外間隙中經過水解激活才能降解細胞外基質。尿激酶纖溶酶原激活物(Urokinase-plasminogen  Activator,UPA)或組織纖溶酶原激活物(Tissue-plasminogen Activator,TPA)將纖溶酶原轉化為纖溶酶,纖溶酶再激活基質分解素,部分激活膠原酶前體,而被激活的基質分解素又進一步激活膠原酶。這一激活的瀑布系統受到纖溶酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)的調節。合成基質金屬蛋白酶的細胞往往同時也合成纖溶酶原激活物抑制因子,以防止基質的過度降解。

(六)金屬蛋白酶組織抑制因子(Tissue Inhibitor of Metalloproteinases,TIMP)

已經激活的基質金屬蛋白酶在細胞外間隙又受到特異性金屬蛋白酶組織抑制因子的調節。現已發現三種TIMP,每種TIMP都可與催化部位直接結合而抑制所有基質金屬蛋白酶的活性,但TIMP-1主要抑制間質性膠原酶、基質分解素和明膠酶B(92KD Ⅳ型膠原酶),TIMP-2主要抑制明膠酶A(72KD Ⅳ型膠原酶)。最近又發現TIMP還能和某些金屬蛋白酶原的羧基末端結合而防止其被激活。

(七)細胞因子(Cytokines)和生長因子(Growth Factors)

細胞外基質可作為貯存細胞因子和生長因子的場所,當其他細胞外基質成分發生改變時并通過各種細胞外基質粘附分子對細胞因子的活性起調節作用,細胞因子又可促進其他細胞外基質的合成或降解。

二. 細胞外基質的細胞來源

肝臟細胞(Liver Cells)可分為:①肝實質細胞即肝細胞(Hepatocyte);②非實質細胞,包括貯脂細胞(Ito細胞)、血竇內皮細胞、Kupffer細胞和陷窩細胞(Pit Cell)。經過體外細胞培養、免疫組織化學及分子原位雜交研究,對細胞外基質的來源有了較多的了解。以前曾認為膠原主要由肝細胞合成,后來發現主要由貯脂細胞產生;而且其他細胞外基質亦主要由貯脂細胞產生。現將細胞外基質的細胞來源歸納于表。

表 細胞外基質的細胞來源

細胞類型 所產生的細胞外基質
肝細胞 Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ型膠原,纖維連接蛋白,VN,蛋白多糖
貯脂細胞 Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ型膠原,層連蛋白,細胞粘合素,副層連蛋白,蛋白多糖
血竇內皮細胞 Ⅳ型膠原,纖維連接蛋白,血栓粘合素
Kupffer 明膠酶,TIMP

6 輔助檢查

一、臨床及影像學診斷

任何慢性肝病尤其是慢性病毒性肝炎患者都有發生肝纖維化和肝硬化的可能性,因此對每一個此類患者都要仔細詢問病史和進行全面的體格檢查,以及早發現早期肝硬化的診斷線索。現代影像學手段如B型超聲CT磁共振成像MRI)等可以發現肝包膜增厚、肝表面輪廓不規則或呈結節狀、肝實質的回聲不均勻增強或CT值增高、各葉比例改變、脾臟厚度增加及門靜脈和脾靜脈直徑增寬等。采色多普勒超聲檢查或放射性核素掃描可以測定肝臟動脈和門脈的血流量及功能性門體分流情況。

二、組織病理學檢查

到目前為止,經肝穿刺或經腹腔鏡肝活檢,進行組織病理學檢查仍是診斷肝纖維化和肝硬化的“金標準”,1994年國際慢性肝炎新的分級、分期標準建議將肝臟纖維增生作為病情分期的依據,與分級(主要是炎癥、壞死的程度)分別評分。國內也提出了相應的分級、分期建議。常規HE染色和各種細胞外基質的組織化學、免疫組織化學甚至分子孫原位雜交技術使我們從肝組織標本中得到期更多的有關肝臟纖維化方面的信息;計算機圖像分析等各種技術更能提供定量的資料以便于觀察抗纖維化治療的效果。但是肝活檢技術也有其局限性,因為慢性肝炎等病變雖然是彌漫性的,但很難保證一次取材能反映整個肝臟的全貌,尤其是肝纖維化和肝硬化時細針負壓肝穿刺難以獲得足夠的標本給診斷帶來一定的困難。為了藥物評價,應做到動態系列進行肝活檢組織病理學檢查。

三、肝纖維化的血清學診斷

鑒于肝臟穿刺組織病理檢查的局限性,人們一直致力于尋找血清學指標來監測肝纖維化的發展過程和判斷抗纖維化的療效。理想的肝纖維化血清學指標應具備一些條件:①肝臟特異性高;②能沒定肝臟纖維增生或降解的過程,反映肝臟纖維化的程度及肝臟實質和間質結構的紊亂;③不被血竇內皮攝取,不經膽道和腎臟排泄;④測定方法簡便易行,敏感性高。實際上現有的測定血清中細胞外基質成分的試驗都不完全符合這些條件,但是經過動物實驗和臨床病理研究發現了不少對判斷肝纖維增生有一定價值的指標。總的來說,在動物實驗中這些指標和肝臟中相應的細胞外基質成分及其mRNA水平有較好的相關性;在臨床研究中這些指標和肝組織病理學纖維化程度也有一定的關聯,慢性活動性肝病(所謂慢性活動性肝炎和活動性肝硬化)時高于非活動性肝病(慢性遷延性肝炎和非活動性肝硬化)。但是各組之間有較多的重疊,難以憑一次結果作出肯定的診斷;聯合應用多項指標和動態測定可能更有助于判斷纖維增生和纖維降解的相對強度。下面僅介紹研究較多的幾種肝纖維化血清學指標。

1.血清Ⅰ型膠原(CI)及Ⅰ型前膠原羧基端肽(PICR)

肝臟中Ⅰ型膠原含量較多,在肝纖維化和肝硬化晚期升高明顯,血清中含量和肝纖維化程度有較高的相關性,有人建立RIA方法并測定了正常人血清CI的含量的上限為197μg/L(M±2SD),在急性肝炎不升高,在各種慢性活動性肝病中升高,且與肝臟纖維化積分的相關系數為0.67(P<0.0001),而與肝臟炎癥指數無相關性。在慢性肝炎和酒精性肝病中若血清CI高于300μg/L,則診斷肝硬化的特異性很高。在酒精性肝病患者血清CI升高且停止飲酒后其血清PICP水平降低,而此時血清CI水平無明顯變化,提示PICP能反映肝臟纖維增生情況,而CI反映的是肝臟原纖維的沉積。但是,CI和CPCP受骨代謝的影響較大,因而肝臟特異性較差,故限制了其臨床應用。

2.血清Ⅲ型膠原(CⅢ)及Ⅲ型前膠原氨基端肽(PⅢNP)

國外有人用RIA其所長測定了正常人的血清CⅢ的上40μg/L(M±2SD),在慢性活動性肝病時升高,其升高可能是新分泌的過量的Ⅲ型膠布原從血竇內皮細胞的間隙漏到血循環。血清中CⅢ水平和肝組織纖維化有相關性(r=0.35,P<0.01),且和炎癥活動也有一定的相關性。國內報道血清CⅢ(PCⅢ)水平和肝組織纖維化程度密切相關(r=0.984,P<0.01),并有人證明在慢性肝炎和肝硬化患者中血清PCⅢ和PⅢP有相關性(r=0.510)。

這是研究得最多的肝纖維化血清學指標。它是Ⅲ型前膠原分泌到細胞外后被肽酶切下的N端肽,端肽(N,C)切下后才形成膠原分子,相互交聯成微纖維。故PⅢNP升高反映的是肝臟纖維增生情況。動物實驗表明血清PⅢNP水平升高和肝臟組織中膠原mRNA及TGF-βmRNA水平的升高密切相關;臨床研究也發現血清PⅢNP水平和肝臟組織纖維化程度有良好的相關性,是反映肝臟纖維增生的指標。也有人認為它和肝臟炎癥活動指數關系更密切,因而在急性肝炎時亦升高;另外它的排泄需要肝血竇內皮細胞的攝取,故在肝功能衰竭時血清中PⅢNP亦升高。臨床上應根據具體情況解釋測定結果。我們應用德國公司生產的PⅢP RIA藥盒(現由日本公司生產)測定了67例各種慢性肝閏伴Ⅰ至Ⅳ級肝纖維化患者的血清PⅢNP水平分別為12.3±3.3ng/ml、17.9±5.5ng/ml、21.5±11.8ng/ml及32.9±12.7ng/ml,表明PⅢP與肝纖維化程度呈正相關。值得注意的是不論是原發性肝癌或是轉移性肝癌患者的血清PⅢP水平均明顯高于其他慢性肝病患者,故對于慢性肝炎患者如血清PⅢP持續異常升高,應警惕肝癌的可能性。

3.血清Ⅳ型膠原(CⅣ)及Ⅳ膠原羧基端肽(CⅣCP,NCI)和Ⅳ膠原氨基端肽(CⅣ NP,7S)

Ⅳ型膠原在合成代謝過程中不需去除端肽而沉積于細胞外基質,故血中Ⅳ型膠原的含量升高可能反映了肝血竇基底膜的更新率(Turnover)加快。基礎和臨床研究均發現血清Ⅳ型膠原水平和肝纖維化及門脈高壓程度密切相關,與肝臟炎癥活動關系較小。

血清CⅣCP(NC1)和CⅣNP(7S)亦與肝纖維化程度相關。因為Ⅳ型膠原在肝血竇、增生的膽管和界板周圍基底膜沉積,故血中CⅣCP(NC1)和CⅣNP(7S)的升高反映了基底膜的持續重建(Remodeling)過程中的降解。在肝臟纖維化晚期纖維性膠原(Ⅰ、Ⅲ型膠原)增生不活躍時這 些指標仍可增高。

4.血清Ⅳ型膠原(CⅣ)

Ⅳ型膠原分布于大的膠原纖維之間,現已有測定CⅣ的RIA和ELISA方法。分子層析實驗證明血清中的檢測到的抗原為CⅣ的降解產物,因而它是一項反映間質膠原降解指標,若和反映間質膠原合成的指標PⅢP聯合應用能更好地了解纖維增生和纖維分解的平衡情況。本指標的另一特點是不受人體生長的影響,故也適用于兒童患者。但是腎纖維化和全身結締組織疾病時血清CⅣ升高也很顯著,臨床上應注意鑒別。

5.血清層連蛋白P1(Lam)

Lam也是基底膜的主要成分,血清Lam水平與肝纖維化程度及門脈-肝靜脈壓力的Laminin P1 RIA藥盒(現由日本公司生產)測定了71例急、慢性肝炎患者的血清Lam,發現慢性活動性肝炎和肝硬化組(3.42±1.13μ/ml,6.58±1.05μ/ml)明顯高于慢性遷延性肝炎組(1.23±0.2μ/ml),且在18例慢性肝病患者中有門脈高壓者(8.07±3.95μ/ml)高于無門脈高壓者(3.63±1.34μ/ml),還發現急性肝炎和原發性肝癌血清LamP1也明顯升高。這些結果和國外學者的報道基本一致。有人認為商品化藥盒所采用的抗原至少有7種成分,而肝臟中只有其中的一、二種,故血清中LamP1水平升高幅度較小而在診斷肝纖維化方面不夠敏感。現已有采用單克隆雙抗體夾心法的新測定方法,其特異性和敏感性更高。

6.血清透明質酸(HA)

肝纖維化時血清HA水平升高一方面是由于貯脂細胞對其合成增加,別一方面可能是由于肝血竇毛細血管化(內皮細胞失去HA受體)、肝血竇內皮細胞受損傷(失去代謝HA的能力)導致肝臟對血清中的HA攝取和降解減少所致。國外學者發現慢性丙型肝炎患者血清HA水平與肝臟纖維化分級呈正相關(r=0.47,P<0.01)且不受年齡的影響,與肝臟炎癥活動指數關系不大;若以90μg/L為界值(Cutt-off),則診斷出2~3級肝纖維化的特異性為92%,敏感性為55%,而且血清HA隨肝纖維化加重或治療好轉而相應升高或降低。國內張魯榕等首先建立HA的RIA測定方法,在254例肝病患者中發現有慢性活動性肝病者HA升高明顯,若以350ng/ml為界值,則診斷肝硬化的敏感性為87.5%。在晚期肝硬化時,由于肝血竇內皮細胞功能更低下,故血清HA值可能更高,此與血清PⅢP等反映活動性肝臟纖維增生的指標不同。

7.血清纖維連續蛋白受體(Fn-R)

Fn-R是Integrin家族的一個成員,肝纖維化時可在肝竇周細胞漿膜和纖維增生區過度表達。日本學者觀察到在慢性肝炎、肝硬化、酒精性肝病和肝細胞癌時血清Fn-R明顯升高并與組織學纖維化程度一致,認為是較好的肝纖維化血清學指標。

8.粗纖維調節素(Undulin)

粗纖維調節素存在于膠原致密纖維的表面,當膠原結構破壞時,它游離出來而進入血中,故和Ⅳ型膠原一樣屬于反映膠原降解的指標。

9.細胞粘合素(Tenascin)

細胞粘合素主要分布于肝血竇周間隙,于肝纖維化早期在中央靜脈周圍、細纖維間隔內及細胞外基質和肝細胞的交界處沉積。可能是一種反映活動性肝纖維增生的指標。

10.金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)

現已有測定血清TIMP-1的ELISA藥盒,有人測定了慢性酒精性肝病患者血清TIMP-1,發現其水平和肝纖維化程度有較高的相關性,且在各組慢性肝病之間重疊較少,是一項反映肝臟細胞外基質降解活性低下的指標。

11.其他指標

因為細胞外基質特別是膠原的代謝涉及到許多酶類,故從理論上來說可以通過測定合成和降解膠原的酶類來判斷肝臟纖維增生和纖維降解的平衡情況。但是酶活性的測定方法繁瑣、影響因素多,且無商品化、標準化的藥盒上市,所以尚未在臨床得到廣泛應用。已經報道過的有賴氨酰氧化酶(Lysy1Oxidase)、血清免疫反應性脯氨酸羥化酶(S-IR-β-PH)、血漿脯氨酸肽酶(Prolidase)及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-acety-β-glucosaminidase,NAG)等,在肝纖維化和肝硬化的診斷方面均有一定的意義。至于以前認為是肝硬化指標的單胺氧化酶MAO)診斷早期肝纖維化的敏感性和特異性均不高,現已不常應用。

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