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杜克雷嗜血桿菌

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1 拼音

dù kè léi shì xuè gǎn jūn

2 英文參考

haemophilus ducreyi[WS/T 191—2017 軟下疳診斷]

3 概述

杜克雷嗜血桿菌(haemophilus ducreyi)為兼性厭氧菌,由Ducrey 1889年在意大利發現。杜克雷嗜血桿菌無運動能力,無芽胞,革蘭染色陰性,短桿狀,兩端鈍圓,長1.6μm~2μm,寬0.5μm,大多數在細胞外呈鏈狀或魚群狀排列,少數在細胞內呈團狀分布[1]

4 杜克雷嗜血桿菌的實驗室檢查方法

4.1 標本采集

4.1.1 取材工具

棉拭子或藻酸鈣拭子。

4.1.2 取材部位

生殖潰瘍或有波動感的腫大淋巴結

4.1.3 皮膚黏膜損害取材

無菌棉拭子輕輕擦去潰瘍表面的痂皮和污物,再用拭子采取分泌物,從潰瘍基底部或邊緣取材,做涂片檢查或培養。

4.1.4 淋巴結取材

選有波動的淋巴結,消毒淋巴結表面皮膚,用無菌干棉球擦干。用ImL無菌注射器配12號針頭,吸取生理鹽水0.25 mL~0.5 mL,以無菌操作穿刺淋巴結并注入鹽水,再吸入注射器內,反復2次~3次后,取抽吸液做涂片檢查或培養。

4.2 顯微鏡檢查

4.2.1 材料

光學顯微鏡、無菌拭子、載玻片、注射器、生理鹽水。

4.2.2 方法

將標本均勻輕輕地涂在干凈的玻片上,然后在空氣中干燥火焰固定。

4.2.3 革蘭染色

操作步驟如下:

a) 將經過固定的涂片鋪滿結晶紫溶液,染30 s~60 s,迅速在流水中洗凈。

b) 用碘液鋪滿涂片,染30 s~60 s,用流水洗凈。

c) 用丙酮乙醇液脫色,直到涂片無紫色脫下為止。通常要10 s~20 s,取決于涂膜的厚薄。避免脫色過分,否則革蘭陽性菌可誤認為陰性菌。很快在流水中淋洗停止脫色,將過量的水用吸水紙吸干。

d) 用復紅液復染1 min,用流水淋洗,用吸水紙吸干。

4.2.4 結果及解釋

使用10×100倍油鏡檢查。

杜克雷嗜血桿菌為革蘭染色陰性,短桿狀,兩端鈍圓,長1.6 μm~2μm,寬0.5μm,大多數在細胞外呈鏈狀或魚群狀排列,少數在細胞內呈團狀分布。

因生殖器潰瘍中常有多種微生物寄居,臨床標本直接涂片革蘭染色鏡檢的結果不可靠,假陽性假陰性較高,故涂片檢查只用于初步判斷,不作為確診依據。

4.3 杜克雷嗜血桿菌運送與分離培養

4.3.1 材料

4.3.1.1 運送培養基

BM-SGA運送培養基。主要成分包括:L-谷氨酰胺、小牛白蛋白V、3 mg/L萬古霉素

4.3.1.2 分離培養基

1.改良Thayer-Martin培養基。主要成分包括:GC基礎培養基粉、血紅蛋白、1%IsoVitaleX增菌劑、3 mg/L萬古霉素。

2.巧克力瓊脂培養基。主要成分包括:肉浸液(肉膏液)瓊脂、無菌脫纖維血、3 mg/L萬古霉素(培養基制備參見附錄B)。

4.3.2 培養條件

將標本接種于培養基上,分區劃線分離。接種了標本的培養基應置于相對濕度80%以上,培養溫度33℃~35℃,5%~10%-氧化碳環境(燭缸)中培養。48 h~72 h觀看結果。未出現陽性結果的平皿應繼續觀察7d后才能丟棄。

4.3.3 培養菌落初步鑒定

菌落特征:杜克雷嗜血桿菌經48 h~72 h培養后,可形成直徑1 mm~2 mm菌落,菌落光滑、呈半透明狀,淺灰色或黃灰色。陳1日性培養物,菌落扁平,顏色變成灰白到棕黃。用白金耳可以完整地將菌落沿瓊脂表面推動,即推動試驗陽性,為杜克雷嗜血桿菌菌落的典型特征。

革蘭染色:從菌落取材做涂片,革蘭染色鏡檢(見A.2)。

4.4 生化鑒定試驗

4.4.1 氧化酶試驗

原理:杜克雷嗜血桿菌酶系統不完善,但能產生弱氧化酶,它產生的氧離子能將氧化酶試劑(鹽酸二甲基對苯胺)氧化成醌類化合物,出現弱顏色反應。但也有報告氧化酶試驗陰性的菌株。

方法:將氧化酶試劑配制成0.5%~1.0%水溶液。將溶液滴加可疑菌落上,觀察顏色變化。 A.

結果:在滴加1%鹽酸二甲基對苯胺溶液后,一般于15 s~20 s內菌落即呈淡紅色,然后逐步變成深紫藍色,最后呈黑色。

臨床意義:氧化酶試驗、菌體形態和菌落形態是初步鑒定杜克雷嗜血桿菌的三個重要標準。

4.4.2 過氧化氫酶試驗

原理:具有觸酶(即過氧化氫酶)的細菌可催化過氧化氫放出初生態氧,繼而形成氧分子出現氣泡。

方法(玻片法):挑取培養基上的菌落,置于干凈的玻片上,然后加1滴3%~6%過氧化氫,立即觀察結果。

結果:于30 s內有氣泡產生者為陽性。

臨床意義:杜克雷嗜血桿菌不產生氣泡因而為陰性。

4.4.3 卟啉試驗

原理:用于檢測細菌將鹽酸δ-氨基-γ-酮戊酸轉變成卟啉及卟吩膽色素原的能力。因為杜克雷嗜血桿菌是嚴格依賴氯化血紅素生長的一種嗜血桿菌,它沒有將鹽酸δ-氨基-γ-酮戊酸轉變成卟啉的能力,試驗結果為陰性反應。

方法:在12 mm×75 mm的試管中加入0.5 mL的2 mmol/L鹽酸-δ-氨基乙酰丙酸溶液中制備濃菌懸液(1×109/mL),將試管放在35℃~37℃孵箱中4h。再將試管于暗室中用wood燈照射,觀察結果。

結果:出現紅色熒光則表示有卟啉存在為陽性。

臨床意義:嚴格依賴氯化血紅素的杜克雷嗜血桿菌缺乏轉變成卟啉能力,因而呈陰性。

4.4.4 硝酸鹽還原試驗

原理:硝酸鹽還原反應包括兩個方面:

1) 細菌在合成代謝過程中,將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽和氮,再由氨轉化成氨基酸和細菌內其他    含氮化合物。

2) 在分解代謝過程中,硝酸鹽或亞硝酸鹽替代氧作為呼吸系統中的終末受氫體。硝酸鹽的還原    過程因細菌而異,杜克雷嗜血桿菌能還原培養基中的硝酸鹽為亞硝酸鹽,亞硝酸鹽與試劑中的醋酸作用,生成亞硝酸,亞硝酸與試劑中的氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸,再與試劑中的α-萘胺結合而成為N-α-萘胺偶氮苯磺酸(紅色)。

方法:取48 h的培養物制成濃菌懸液(109/mL),取0.04 mL于小試管中,加入0.04 mL 0.05% NaNO3溶液和0.04 mL的25 mmol/L磷酸緩沖液(pH 6.8)。在35℃水浴孵育1 h。分別加入0.5%對氨基苯磺酸乙酸溶液和0.5%萘胺乙酸溶液各0.06 mL,搖勻,觀察。

結果:2 min~10 min內顯色,出現粉紅色為陽性,不出現粉紅色為陰性。

臨床意義:杜克雷嗜血桿菌硝酸鹽還原試驗陽性。

4.4.5 堿性磷酸酶試驗

方法:在含0.5 mL 0.03%無酚磷酸二鈉試管中制備濃菌懸液(109/mL)。將試管置37℃水浴孵育4h,加4滴0.5%2,6-二溴醌-4-氯亞胺甲醇溶液,搖勻,置室溫15 min。加入0.3 mL n-丁醇,搖勻靜置5 min。觀察。

結果:在丁醇層出現藍紫色為陽性。

臨床意義:杜克雷嗜血桿菌堿性磷酸酶試驗陽性。

4.4.6 杜克雷嗜血桿菌生化試驗鑒定結果

嗜血桿菌氧化酶試驗陽性,過氧化氫酶試驗陰性,卟啉試驗陰性,硝酸鹽還原試驗陽性,堿性磷酸酶試驗陽性。

4.4.7 培養意義及注意事項

杜克雷嗜血桿菌培養法的敏感性為60%~80%,是目前世界衛生組織推薦和診斷軟下疳病人的主要實驗室方法。杜克雷嗜血桿菌對環境的抵抗力很弱,為提高培養的成功率,標本的離體時間越短越好,取材后應立即接種于分離培養基。對不能及時接種到分離培養基的臨床標本,應置于運送培養基,但必須在一周內轉種到分離培養基上。

4.5 運送和分離杜克雷嗜血桿菌培養基的制備

4.5.1 運送培養基BM-SGA制備

4.5.1.1 BM成分

BM成分如下:

a) 磷酸氫二鈉Na2HPO4)  10.0 g;

b) 硝酸鎂(magnesium nitrate) 0.1 g;

c) 磷酸二氫鉀(KH2PO4)2.0 g;

d) 氯化鈉(sodium chloride) 5.0 g;

e) 氯化鈣(Calcium Chloride) 0.1 g;

f) 血紅素0.2 g;

g) 巰基乙酸鈉(sodium thiglycollate) 1.0 g;

h) Bacto瓊脂7.5 g;

i) 蒸餾水990 mL;

j) 調pH至7.5。

4.5.1.2 SGA成分

SGA成分如下:

a) 二氧化硒(SeO2) 0.003 mg/L;

b)L-谷氨酰胺(L-glutamine)3 mg/L;

c) 萬古霉素(vancomycin)3 mg/L;

d) 牛血清蛋白(白蛋白)2.0 g/L;

e) 蒸餾水10 mL。

4.5.1.3 配制方法

SGA成分采用孔徑為0.45μm濾膜過濾除菌備用。BM成分于121℃滅菌15 min,待冷至50℃,無菌操作加入SGA溶液混勻,分裝于帶螺旋蓋的無菌試管內,每管6 mL,放4℃可用30 d。

4.5.2 分離培養基制備

4.5.2.1 改良Thayer-Martin培養基制備
4.5.2.1.1 成分

GC基礎培養基粉

每3.6 g GC基礎培養基粉可配100 mL T-M成品培養基,其中含蛋白胨1.5 g、玉米粉0.1 g、磷酸氫二鉀(K2HPO4)0.4 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.1 g、氯化鈉(NaCl)0.5 g和瓊脂1.2 g。

VCN抑菌劑

1 mL溶液中含萬古霉素(vancomycin) 300μg、粘菌素(colistin) 750μg和制霉菌素(nystatin)1250單位。為抑制變形桿菌可加三甲氧芐氨嘧啶500μg。制成后立即用完或貯存-200C以下于2周內用完。

lsoVitaleX增菌劑

每1L蒸餾水中加入成分如下:

a) 維生素B12 (vitamin B12) 0.01 g;

b) L-谷氨酰胺(L-glutamine)  10.0 g;

c) P-氨基苯甲酸(P-aminobenzoic acid) 0.012 g;

d) 腺嘌呤(adenine)1.0 g;

e) 鳥嘌呤(guanine)0.03 g;

f) 二磷酸吡啶核苷酸(diphosphopyridine nucleotide osidized,coenzyme Ⅰ)0.25 g;

g) 輔羧酶(cocarboxylase)0.1 g;

h) 硝酸鐵(ferric nitrate)0.02 g;

i) 鹽酸硫胺(thiamine HCl) 0.003 g;

j) L-半胱氨酸(L-cysteine) 25.9 g;

k) L-胱氨酸(L-cystine)1.1 g;

1) 葡萄糖(dextrose) 100 g。

4.5.2.1.2 配制

以配500 mL T-M培養基為例,具體配制如下:

a) 制取雙倍濃度的基礎培養基:將GC基礎粉18 g溶于235 mL蒸餾水中(用500 mL燒瓶),充分搖勻,邊加熱邊攪動,直至煮沸1 min,使之完全溶解

b) 將5g血紅蛋白粉加到250 mL水中制成2%溶液。混合時,5g血紅蛋白先加水5 mL~10 mL,研成糊狀,再逐步加入蒸餾水,使整個溶液成勻漿狀。也可用2%血紅蛋白溶液成品。

c) 將上述二液分別以121℃高壓滅菌15 min后冷卻到500C左右備用。2%血紅蛋白溶液成品不必高壓,只需在臨用前稍加熱即可。

d) 配制增菌液:每安瓿增菌劑加入隨同附來的稀釋液10 mL,使溶解。

e) 配制抑菌劑:每安瓿抑菌劑用無菌操作加入蒸餾水5 mL,搖動,使充分溶解。

f) 用無菌操作將2%血紅蛋白溶液250 mL、增菌液10 mL、抑菌劑5 mL和GC培養基235 mL混合。

總體積為500 mL,可倒70 mm平皿25個~30個。

4.5.2.2 巧克力瓊脂的配制
4.5.2.2.1 成分

肉浸液(或肉膏液)瓊脂(pH 7.2~7.4)1000 mL,無菌脫纖維血(羊血兔血)80 mL~100 mL,萬古霉素3 mg/L(或多粘菌素B 25 U/mL)。

4.5.2.2.2 配制

將肉浸液瓊脂高壓滅菌,待涼至45℃時加入脫纖維血(血液在臨用前置于370C水浴預熱),搖勻后再置于水浴中,徐徐加熱到85℃~90℃作用5 min~10 min,再冷卻到50℃左右。為抑制雜菌,在冷卻到45℃左右時加入萬古霉素3 mg/L(或多粘菌素B 25 U/mL),再輕輕搖勻后傾注于滅菌平皿中。

5 參考資料

  1. ^ [1] 中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.WS/T 191—2017 軟下疳診斷[Z].2017-7-24.

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  • 評論總管
    2019/10/15 15:09:03 | #0
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