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單克隆抗體

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1 拼音

dān kè lóng kàng tǐ

2 英文參考

monoclonal antibody

3 英文翻譯

monoclonal antibody

4 概述

單克隆抗體是由淋巴細胞雜交瘤產生的、只針對復合抗原分子上某一單個抗原決定簇特異性抗體。淋巴細胞雜交瘤是用人工方法使骨髓瘤細胞純系小鼠的腹水瘤型漿細胞)與已用抗原致敏并能分泌某種抗體的淋巴細胞(常用致敏動物的脾細胞,起作用的是其中的B細胞)融合而成的。用來使上述淋巴細胞致敏的抗原有人和動物的T細胞、B細胞、紅細胞腫瘤細胞、各種微生物或其他抗原物質等。這種融合細胞既具有腫瘤細胞能大量、無限繁殖的特性,又具有B細胞能合成分泌特異性抗體的能力。由于一個B細胞克隆只針對一個抗原決定簇產生相對應的抗體,所以一個B細胞與骨髓瘤細胞融合而成的單個雜交瘤細胞,也只產生某種單一的抗體。采用適當方法把雜交瘤細胞分離出來,進行單個細胞培養,使之大量繁殖,則在該培養液中增殖而形成的細胞克隆,只產生完全均一的、單一特異性的抗體,即單克隆抗體。若把能產生特異性抗體的單克隆雜交瘤進行大量培養,或注入原系動物腹腔中,則雜交瘤仍以腹水型方式生長,在培養液或腹水中會含有大量單克隆抗體。用雜交瘤技術制備出來的單克隆抗體純度高、專一性強、效價高,使用時可免除不同細胞及微生物種或株間血清學上的交叉反應,大大提高了診斷的特異性及敏感性。另外,在研究細胞表面標志、提純可溶性抗原、進一步研究抗體的結構功能等方面都起著十分重要的作用。

4.1 免疫反應

免疫反應是人類對疾病具有抵抗力的重要因素。當動物體受抗原刺激后可產生抗體。抗體的特異性取決于抗原分子的決定簇,各種抗原分子具有很多抗原決定簇,因此,免疫動物所產生的抗體實為多種抗體的混合物。用這種傳統方法制備抗體效率低、產量有限,且動物抗體注入人體可產生嚴重的過敏反應。此外,要把這些不同的抗體分開也極困難。

近年來,基于生物膜系統的研究和細胞工程的發展,單克隆抗體技術也隨之出現,可謂免疫學領域的重大突破。

4.2 抗體

抗體是由B淋巴細胞分化形成的漿細胞合成、分泌的。每一個B淋巴細胞在成熟的過程中通過隨機重排只產生識別一個抗原的抗原受體基因。動物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細胞系,重排后具有不同基因不同的B淋巴細胞合成不同的抗體。當機體受抗原刺激時,抗原分子上的許多決定簇分別激活各個具有不同基因的B細胞。被激活的B細胞分裂增殖形成效應B細胞(漿細胞)和記憶B細胞,大量的漿細胞克隆合成和分泌大量的抗體分子分布血液體液中。如果能選出一個制造一種專一抗體的漿細胞進行培養,就可得到由單細胞經分裂增殖而形成細胞群,即單克隆。單克隆細胞將合成針對一種抗原決定簇的抗體,稱為單克隆抗體。

5 單克隆抗體的基本概念

單克隆抗體是指由淋巴細胞雜交瘤產生的、只針對復合抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。淋巴細胞雜交瘤是用人工方法使骨髓瘤細胞(純系小鼠的腹水瘤型漿細胞)與已用抗原致敏并能分泌某種抗體的淋巴細胞(常用致敏動物的脾細胞,起作用的是其中的B細胞)融合而成的。用來使上述淋巴細胞致敏的抗原有人和動物的T細胞、B細胞、紅細胞、腫瘤細胞、各種微生物或其他抗原物質等。這種融合細胞既具有腫瘤細胞能大量、無限繁殖的特性,又具有B細胞能合成分泌特異性抗體的能力。由于一個B細胞克隆只針對一個抗原決定簇產生相對應的抗體,所以一個B細胞與骨髓瘤細胞融合而成的單個雜交瘤細胞,也只產生某種單一的抗體。采用適當方法把雜交瘤細胞分離出來,進行單個細胞培養,使之大量繁殖,則在該培養液中增殖而形成的細胞克隆,只產生完全均一的、單一特異性的抗體,即單克隆抗體。若把能產生特異性抗體的單克隆雜交瘤進行大量培養,或注入原系動物腹腔中,則雜交瘤仍以腹水型方式生長,在培養液或腹水中會含有大量單克隆抗體。用雜交瘤技術制備出來的單克隆抗體純度高、專一性強、效價高,使用時可免除不同細胞及微生物種或株間血清學上的交叉反應,大大提高了診斷的特異性及敏感性。另外,在研究細胞表面標志、提純可溶性抗原、進一步研究抗體的結構和功能等方面都起著十分重要的作用。

6 單克隆抗體技術的基本原理

要制備單克隆抗體需先獲得能合成專一性抗體的單克隆B淋巴細胞,但這種B淋巴細胞不能在體外生長。而實驗發現骨髓瘤細胞可在體外生長繁殖,應用細胞雜交技術使骨髓瘤細胞與免疫的淋巴細胞二者合二為一,得到雜種的骨髓瘤細胞。這種雜種細胞繼承兩種親代細胞的特性,它既具有B淋巴細胞合成專一抗體的特性,也有骨髓瘤細胞能在體外培養增殖永存的特性,用這種來源于單個融合細胞培養增殖的細胞群,可制備抗一種抗原決定簇的特異單克隆抗體。其制備原理示意如下:

單克隆抗體制備原理
單克隆抗體制備原理

單克隆抗體是僅由一種類型的細胞制造出來的抗體,對應于多克隆抗體/多株抗體——由多種類型的細胞制造出來的一種抗體。

單克隆抗體由可以制造這種抗體的免疫B細胞與骨髓瘤細胞融合后的細胞產生的,這種融合細胞即具有瘤細胞不斷分裂的能力,又具有免疫細胞能產生抗體的能力。融合后的雜交細胞(雜種瘤)可以產生大量相同的抗體。當其應用于醫療中時,在識別抗原中的顯示的微小變化(如果有的話)有助于減小副作用

1975年,瑞士科學家喬治·克勒和英國科學家凱撤·米爾斯坦,把產生抗體的B淋巴細胞與多發性骨髓瘤細胞進行融合,形成雜交瘤細胞。這種細胞兼有兩個親代細胞的特征,既有骨髓瘤細胞無限生長的能力,又有B淋巴細胞產生抗體的功能。因此,這種雜交瘤細胞就能在細胞培養中產生大量單一類型的高純度抗體。這種抗體叫“單克隆抗體”。

7 單克隆抗體的制備

1975年Kǒhler和Milstein首先報道用細胞雜交技術使經綿羊紅細胞(SRBC)免疫的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合,建立起第一個B細胞雜交瘤細胞株,并成功地制得抗SRBC的單克隆抗體(monlclonalantibody,McAb)。迄今世界已研制成數以千計的McAb。

單克隆抗體的理化性狀高度均一,生物活性單一,與抗原結合的特異性強,便于人為處理和質量控制,并且來源容易,所以一問世便受到歡迎和重視。在醫學域中,McAb在診斷疾病、判斷預后、防治疾病以及疾病機制研究等方面起著巨大的促進作用。為此,兩位發明者于1984年獲得諾貝爾醫學獎。

7.1 雜交瘤技術的基本原理

雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠細胞作小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養基中生長(選擇原理后見),小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖,即所謂永生性。在選擇培養基的作用下,只有B細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交才具有持續增殖的能力,形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特征的細胞克隆。其原理從下列幾個主要步驟闡明。

7.1.1 (一)細胞的選擇與融合

建立雜交瘤技術的是制備對抗原特異的單克隆抗體,所以融合細胞一方必須選擇經過抗原免疫的B細胞,通常來源于免疫動物的碑細胞。脾是B細胞聚集的重要場所,無論以何種免疫方式刺激,脾內皆會出現明顯的抗體應答反應。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增殖,只有腫瘤細胞才具備這種特性。選擇同一體系的細胞可增加融合的成功率。多發性骨髓瘤是B細胞系惡性腫瘤,所以是理想的脾細胞融合伴侶。目前常用的B細胞瘤株有:P3-X63-Ag8(KǒhlerandMilstein,1975),P3-NSI/1-Ag4-1(KǒhlerandMilstein,1976),X63-Ag8.563(Kearneyetal,1979),Sp2/0-Ag14(Schulmanetal,1978)等,這些細胞株皆為HAT敏感細胞株。

使用細胞融合劑造成細胞膜一定程度的損傷,使細胞易于相互粘連而融合在一起。最佳的融合效果應是最低程度的細胞損傷而又產生最高頻率的融合。聚乙二醇(PEG1000~2000)是目前最常用的細胞融合劑,一般應用濃度為40%(W/V)。

7.1.2 (二)選擇培養基的應用

細胞融合是一個隨機的物理過程。在小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞混合細胞懸中,經融合后細胞將以多種形式出現。如融合的脾細胞和瘤細胞、融合的脾細胞和脾細胞、融合的瘤細胞和瘤細胞、未融合的脾細胞、未融合的瘤細胞以及細胞的多聚體形式等。正常的脾細胞在培養基中存活僅5~7天,無需特別篩選,細胞的多聚體形式也容易死去。而未融合的瘤細胞則需進行特別的篩選去除。

細胞DNA合成一般有兩條途徑。主途徑是由糖和氨基酸合成核苷酸,進而合成DNA,葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。另一輔助途徑是在次黃嘌呤胸腺嘧啶核苷存在的情況下,經次黃嘌呤磷酸核糖轉化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的催化作用合成DNA。細胞融合的選擇培養基中有三種關鍵成分:次黃嘌呤(hypoxanthine,H)、氨甲蝶呤(aminopterin,A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine,T),所以取三者的字頭稱為HAT培養基。氨甲蝶呤是葉酸的拮抗劑,可阻斷瘤細胞利用正常途徑合成DNA,而融合所用的瘤細胞是經毒性培養基選出的HGPRT細胞株,所以不能在該培養基中生長。只有融合細胞具有親代雙方的遺傳性能,可在HAT培養基中長期存活與繁殖(圖11-1)。

圖11-1細胞融合與HAT選擇示意圖

7.1.3 (三)有限稀釋與抗原特異性選擇

在動物免疫中,應選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇,一個動物體在受到抗原刺激后產生的體液免疫應答,實質是眾多B細胞群的抗體分泌。而針對目標抗原表位的B細胞只占極少部分。由于細胞融合是一個隨機的過程,在已經融合的細胞中,有相當比例的無關細胞的融合體,需細篩選去除。篩選過程一般分為兩步進行:一是融合細胞的抗體篩選,二是在此基礎上進行的特異性抗體篩選。將融合的細胞進行充分稀釋,使分配到培養板的每一孔中的細胞數在0至數個細胞之間(30%的孔為0才能保證每個孔中是單個細胞),培養后取上清以ELISA法選出抗體高分泌性的細胞;這一過程常被習慣地稱作克隆化。將這些陽性細胞再進行克隆化,應用特異性抗原包被ELISA出針對目標抗原的抗體陽性細胞株,增殖后進行凍存、體外培養或動物腹腔接種培養。

7.2 制備單克隆抗體的基本技術

制備單克隆抗體是復雜而費時的工作,整個技術流程如圖11-2。

7.2.1 (一)抗原提純與動物免疫

對抗原的要求是純度越高越好,尤其是初次免疫所用的抗原。如為細胞抗原,可取1×107個細胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐劑并經充分乳化,如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原,可將抗原所在的電泳條帶切下,研磨后直接用以動物免疫。

選擇與所用骨髓瘤細胞同源的BALB/c健康小鼠,鼠齡在8~12周,雌雄不限。為避免小鼠反應而不佳或免疫過程中死亡,可同時免疫3~4只小鼠。

免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同,因動物、抗原形式、免疫途徑不同而異,以獲得高效價抗體為最終目的。免疫間隔一般2~3周。一般被免疫動物的血清抗體效價越高,融合后細胞產生高效價特異抗體的可能性越大,而且單克隆抗體的質量(如抗體的濃度和親和力)也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關。末次免疫后3~4天,分離脾細胞融合。

7.2.2 (二)骨髓瘤細胞及飼養細胞的制備

選擇瘤細胞株的最重要的一點是與待融合的B細胞同源。如待融合的是脾細胞,各種骨髓瘤細胞株均可應用,但應用最多的是Sp2/0細胞株。該細胞株生長及融合效率均佳,此外,該細胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細胞的最高生長刻度為9×105/ml,倍增時間通常為10~15h。融合細胞應選擇處于對數生長期、細胞形態和活性佳的細胞(活性應大于95%)。骨髓瘤細胞株在融合前應先用含8-氮鳥嘌呤的培養基作適應培養,在細胞融合的前一天用新鮮培養基調細胞濃度為2105/ml,次日一般即為對數生長期細胞。

圖11-2雜交瘤技術制備單克隆抗體的流程

在體外培養條件下,細胞的生長依賴適當的細胞密度,因而,在培養融合細胞或細胞克隆化培養時,還需加入其他飼養細胞(feedercell)。常用的飼養細胞為小鼠的腹腔細胞,制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔,輕揉腹部數次,吸出后的液體中即含小鼠腹腔細胞,其中在巨噬細胞和其他細胞。亦有用小鼠的脾細胞、大鼠或豚鼠的腹腔細胞作為飼養細胞的。

在制備飼養細胞時,切忌針頭刺破動物的消化器官,否則所獲細胞會有嚴重污染。飼養細胞調至1×105/ml,提前一天或當天置板孔中培養。

7.2.3 (三)細胞融合

細胞融合是雜交瘤技術的中心環節,基本步驟是將兩種細胞混合后加入PEG使細胞彼此融合。其后吧培養液稀釋PEG,消除PEG的作用。將融合后的細胞適當稀釋,分置培養板孔中培養。融合過程中有幾個問題應特別注意。①細胞比例:骨髓瘤細胞與脾細胞的比值可從1:2到1:10不等,常用1:4的比例。應保證兩種細胞在融合前都具有較高活性。②反應時間:在兩種細胞的混合細胞懸液中,第1min滴加4.5ml培養液;間隔2min滴加5ml培養液,爾后加培養液50ml。③培養液的成分:對融合細胞,良好的培養液尤其重要,其中的小牛血清、各種離子營養成分均需嚴格配制。如融合效率降低,應隨時核查培養基情況。

7.2.4 (四)有限稀釋法

篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細胞為HAT敏感細胞株,所以只有融合的細胞才能待續存活一周以上。融合細胞呈克隆生長,經有限稀釋后(一般稀釋至0.8個細胞/孔),按Poisson法計算,應有36%的孔為1個細胞/孔。細胞培養至覆蓋0%~20%孔底時,吸取培養上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔,將孔中細胞再行克隆化,爾后進行抗原特異的ELISA測定,選高分泌特異性細胞株擴大培養或凍存。

7.2.5 (五)單克隆抗體的制備和凍存

篩選出的陽性細胞株應及早進行抗體制備,因為融合細胞隨培養時間延長,發生污染、染包體丟失和細胞死亡的機率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養法,即將雜交瘤細胞在體外培養,在培養液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設備,一般應用無血清培養基,以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠,先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射,一周后將雜交瘤細胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產生,每只小鼠可收集5~10ml的腹水,有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高,每毫升可達數毫克甚至數十毫克水平。此外,腹水中的雜蛋白也較少,便于抗體的純化。接種細胞的數量應適當,一般為5×105/鼠,可根據腹水生長情況適當增減。

選出的陽性細胞株應及早凍存。凍存的溫度越低越好,凍存于液氮的細胞株活性僅有輕微的降低,而凍存在-70℃冰箱則活性改變較快。細胞不同于菌種,凍存過程中需格外小心。二甲亞砜(DMSO)是普遍應用的凍存保護劑。凍存細胞復蘇后的活性多在50%~95%之間。如果低于50%,則說明凍存復蘇過程有問題。

7.2.6 (六)單克隆抗體的純化

單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化,腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高,純化效果好。按所要求的純度不同采用相應的純化方法。一般采用鹽析凝膠過濾和離子交換層析等步驟達到純化目的,也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法,多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體(最常用Sepharose)交聯,制備親和層析柱將抗體結合后洗脫,回收率可達90%以上。蛋白可與IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3結合,同時還結合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測,小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm時,1.44(吸光單位)相當于1mg/ml。經低pH洗脫后在收集管內預置中和液或速加中和液對保持純化抗體的活性至關重要。

8 單克隆抗體的應用

把單克隆抗體與抗癌藥物毒素結合起來,就成為威力強大的抗體“生物導彈”。把這種抗體“導彈”注射到癌癥患者的血液中,它就會發揮導彈樣的作用,在患者體內追蹤并附著于癌細胞上,然后與抗體結合的抗癌藥物或毒素殺傷和破壞癌細胞,而且很少損傷正常組織細胞。這種抗體“導彈”具有高度選擇性,對癌細胞命中率高,殺傷力強的優點,沒有一般化學藥物那樣不分好壞細胞,格殺勿論的缺點。美國約翰·霍普金斯醫院應用抗體“導彈”治療晚期肝癌病人,收到驚人效果。肝臟腫癌顯著縮小,生存期延長,而且沒有副作用。單克隆抗體技術的發明,是免疫學中的一次革命,打破了過去只能在身體內產生抗體的方法,而成功地在體外用細胞培養的方法產生抗體,同時繁殖快,可以產生在體內達不到的高滴度和高專一性的水平。它來自于每一個細胞,所以非常純凈。

單克隆抗體在疾病的診斷和治療預防方面,與常規的抗體相比,特異性強,靈敏度高,優越性非常明顯,可利用此特性制成“生物導彈”用來運送藥物至病害部位,主要是癌細胞。

單克隆抗體在生物學和醫學研究領域中顯示了極大的應用價值,是親和層析中重要的配體,是免疫組化中主要的抗體,是免疫檢驗中的新型試劑,是生物治療的導向武器。

作為醫學檢驗試劑,單克隆抗體可以充分發揮其優勢。單克隆抗體的特異性強,可將抗原抗體反應的特異性大大提高,減少了可能的交叉反應,使試驗結果可信度更大。單克隆抗體的均一性和生物活性單一性使抗原抗體反應結果便于質量控制,利于標準化和規范化。目前已有許多檢驗試劑盒用單抗制成,其主要用途如下:

8.1 1.診斷各類病原體

這是單克隆抗體應用最多的領域,已有大量的商品診斷試劑供選擇。如用于診斷乙肝病毒、皰疹病毒巨細胞病毒EB病毒和各種微生物感染的試劑等。單克隆抗體具有靈敏度高、特異性好的特點。尤其在鑒別菌種型及亞型、病毒變異株以及寄生蟲不同生活周期抗原性等方面更具獨特優勢。

8.2 2.腫瘤特異性抗原和腫瘤相關抗原的檢測

用于腫瘤的診斷、分型及定位。盡管目前尚未制備出腫瘤特異性抗原的單克隆抗體,但對腫瘤相關抗原(例如甲胎蛋白癌胚抗原)的單克隆抗體早已用于臨床檢驗。

近年來,有人利用單克隆抗體進行腫瘤分型,對制定治療方案和判斷預后也有幫助。用抗腫瘤單抗檢查病理標本,可協助確定轉移腫瘤的原發部位。以放射性核素標記單克隆抗體主要用于體內診斷,結合X線斷層掃描技術,可對腫瘤的大小及其轉移灶作出定位診斷。

8.3 3.檢測淋巴細胞的表面標志

用于區分細胞亞群和細胞分化階段。例如檢測CD系列標志,有助于了解細胞的分化和T細胞亞群的數量和質量變化,對多種疾病診斷具有參考意義。對細胞表面抗原的檢查在白血病患者的疾病分期、治療效果、預后判斷等方面也有指導作用。組織相容性抗原是移植免疫學的重要內容,而應用單克隆抗體對HLA進行位點檢查與配型可得到更可信的結果。

8.4 4.機體微量成分的測定

應用單克隆抗體和免疫學技術,可對機體的多種微量成分進行測定,如諸多酶類、激素維生素、藥物等;對受檢者健康狀態判斷、疾病檢出、指導診斷和治療均具有實際意義。

上述應用的單克隆抗體屬于鼠源性,作為體外診斷試劑是滿意的。鼠源單克隆抗體如作為生物制劑應用于人體,則因是異性蛋白可引起過敏反應甚至危及生命。從臨床治療及預防疾病的要求,希望制備出人源性單克隆抗體。目前雖然已有文獻報道,通過人-鼠細胞雜交及人-人細胞雜交進行了一些探索,但對這些細胞株培養很不穩定,融合細胞中人染色體往往呈選擇性丟失,以致細胞株難以維持培養。因此制備人源單克隆抗體是目前急待解決的問題。

9 單克隆抗體藥品說明書

9.1 適應癥

單克隆抗體被認為對人類癌的診斷和治療有很高的價值,能分辨正常細胞和惡性細胞的質量和數量。并能與腫瘤結合而達到治療作用。

9.2 注意事項

有過敏反應、寒戰出汗腹瀉呼吸困難發熱、潮紅、頭疼高血壓骨髓抑制惡心嘔吐、皮疹、血清病等。

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  • 藥學小同學
    2011/7/2 19:19:10 | #1
    很好~~學了不少
抱歉,功能升級中,暫停討論
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