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沉淀反應

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1 拼音

chén diàn fǎn yìng

2 英文參考

precipitation

3 概述

沉淀反應是一種血清反應。沉淀反應指可溶性抗原抗體結合,形成不溶性的、可以看見的沉淀物的過程。利用沉淀反應,曾提出各種有關抗原、抗體的定性或定量方法。最簡單的方法是將抗血清放入細玻璃管內,將抗原液輕輕地加于其上,短時間(1—2分鐘內)內便可在界面生成白色沉淀(環狀試驗)。又將抗原液同抗血清以最適當比例混合,用離心法收集沉淀物而測定其數量,由此可以測知抗體量或抗原量。沉淀反應在瓊脂之類的凝膠內進行,可普遍應用于檢查抗原或抗體的濃度及組成的目的。

4 沉淀反應的抗原

沉淀反應的抗原可以是多糖蛋白質類脂等。同相應抗體比較,抗原的分子小,單位體積內含有的抗原量多,做定量試驗時,為了不使抗原過剩,應稀釋抗原,并以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價習慣上將參與沉淀反應的抗原稱為沉淀原,抗體稱沉淀素

5 液體內沉淀試驗

5.1 絮狀沉淀試驗

絮狀沉淀試驗為歷史較久,又較有用的方法。該法要點是:將抗原與抗體溶液混合在一起,在電解質存在下,抗原與抗體結合,形成絮狀沉淀物。這種沉淀試驗受到抗原和抗體比例的直接影響,因而產生了兩種最適比例的基本測定方法

5.1.1 (一)抗原稀釋法

抗原稀釋法(Dean-Webb法)是將可溶性抗原作一系列稀釋,與恒定濃度的抗血清等量混合,置室溫或37℃反應后,產生的沉淀物隨抗原的變化而不同。表12-1系以牛血白蛋白為例的實驗結果。

表12-1Dean-Webb定量沉淀試驗

管號 抗原 抗體 總沉淀量 反應過剩物 抗原沉淀量 抗體沉淀量 沉淀中Ab/Ag
1 0.003 0.68 0.093 Ab 0.003 0.090 30.0
2 0.005 0.68 0.145 Ab 0.005 0.140 28.0
3 0.011 0.68 0.249 Ab 0.011 0.238 21.7
4 0.021 0.68 0.422 Ab 0.021 0.401 19.1
5 0.032 0.68 0.571 Ab 0.032 0.539 16.8
6 0.043 0.68 0.734 0.043 0.691 16.1
7 0.064 0.68 0.720 Ab
8 0.085 0.68 0.601 Ag
9 0.171 0.68 0.464 Ag
10 0.341 0.68 0.368 Ag

單位:mmol/L

從表12-1可以看出,1~5管為抗體過剩管,7~10管為抗原過剩管,唯第6管沉淀物最多,兩者之比為16:1,即最適比。

5.1.2 (二)抗體稀釋法(Ramon)法

本法采用恒定的抗原量與不同程度稀釋的抗體反應,計算結果同上法,得出的是抗體結合價和最適比。

現今,為了取得抗原與抗體的最佳比例,已將以上兩法相結合,即抗原和抗體同時稀釋,稱為棋盤格法(亦稱方陣法),找出最佳配比。舉例見表12-2。

表12-2方陣最適比測定

抗體稀釋度 抗原稀釋度
1/10 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/12 對照  
1/5 ++ +++ +++ ++ ±
1/10 ++ ++ ++ +++ ++
1/20 ++ ++ +++ ++
1/40 ± ++ +++ ++
1/80

“+”為沉淀物量:為最適比

從表12-2可以看出,方陣法可較正確地找出抗原與抗體的最適比。如抗體用1:40。抗原則按1:320稀釋;如抗原是1:160,抗本則用1:20最為恰當。

5.2 環狀沉淀試驗

環狀沉淀試驗是Ascoli于1902年建立的,其方法是:先將抗血清加入內徑1.5~2mm小玻管中,約裝1/3高度,再用細長滴管沿管壁疊加抗原溶液。因抗血清蛋白濃度高,比重較抗原大,所以兩液交界處可形成清晰的界面。此處抗原抗體反應生成的沉淀在一定時間內不下沉。一般在室溫放置10min至數小時,在兩液交界處呈現白色環狀沉淀則為陽性反應。本技術的敏感度為3~20μg/ml抗原量。環狀試驗中抗原、抗體溶液須澄清。該試驗主要用于鑒定微量抗原,如法醫學中鑒定血跡,流行病學用于檢查媒介昆蟲體內的微量抗原等,亦可用于鑒定細菌多糖抗原。因該技術敏感度低,且不能作兩種以上抗原的分析鑒別,現已少用。

6 凝膠內沉淀試驗

最常用的凝膠為瓊脂糖。由于凝膠內沉淀試驗具有高度的敏感性和特異性,且設備簡單、操作方便,因而得到廣泛應用。

該試驗利用可溶性抗原和相應抗體在凝膠中擴散,形成濃度梯度,在抗原與抗體濃度比例恰當的位置形成肉眼可見的沉淀線或沉淀環。適宜濃度的凝膠可視為一種固相的液體,水分占98%以上,凝膠形成網絡,將水分固相化。抗原和抗體蛋白質在此凝膠內擴散,猶如在液體中自由運動。大分子(分子量為20萬以上)物質在凝膠中擴散較慢,可利用這點識別分子量的差別。另外,由于瓊脂網孔有一定的限度,抗原抗體結合后,復合物的分子量至少應在百萬以上,這種超大分子則被網絡在瓊脂中,經鹽水浸泡也只能去除游離的抗原或抗體,這對后面的分析帶來極大的方便。

凝膠內沉淀試驗可根據抗原與抗體反應的方式和特性,分為單向擴散試驗和雙向擴散試驗。

6.1 單向擴散試驗

本試驗是在瓊脂膠中混入一定量抗體,使待測的抗原溶液從局部向瓊脂內自由擴散,在一定區域內形成可見的沉淀環。根據試驗形成可分為試管法和平板法兩種。

6.1.1 (一)試管法

該方法由Oudin于1946年報道。將血清或純化抗體混入約50℃的0.7%瓊脂糖溶液中,注入小口徑試管內,待凝固后,在凝膠中面加入抗原溶液,讓抗原自由擴散入凝膠內,在抗原與抗體比例恰當位置形成沉淀環。在黑色背景斜射光處,極易觀察這種白色不透明沉淀帶。

沉淀環的數目和形態受抗原和抗體性質的影響。溶液內含有多種抗原,在凝膠中含有各自的抗體,擴散后形成相應的抗原抗體復合物,出現多條區帶。試管上部的沉淀帶表示抗原量少或者抗體量多;反之,下面的沉淀帶則是抗原量大,抗體量少。另外,抗體類型也有很大區別,如用兔抗血清(R型抗體),抗體過量亦可形成復合物,因而沉淀帶寬而界線不清;如用馬抗血清(H型抗體),抗原或抗體過量皆不形成復合物,因而只在比例合適處形成界線清晰的沉淀物(圖12-1)。

圖12-1兩種抗血清形成的沉淀帶示意圖

6.1.2 (二)平板法

此法由Mancini于1965年提出,是目前最常用的簡易抗原定量技術,其要點是:將抗體或抗血清混入0.9%瓊脂糖內(約50℃),未凝固前傾注成平板,凝固后在瓊脂板上打孔(一般直徑約3~5mm),孔中加入抗原溶液,放室溫或37℃讓其向四周擴散,24~48h后可見周圍出現沉淀環(圖12-2)。

圖12-2單向輻射狀免疫擴散

上排為5個不同的參考中、下排為患者血清

下排右2為一異常病理血

由于試驗中抗原向四周擴散,故又稱單向輻射狀免疫擴散(singleradialimmunodeffusion,SRID)。最后,測量沉淀環的直徑或計算環的面積。沉淀環直徑或面積的大小與抗原量相關,但不是直線相關,而是對數關系。同時,這種沉淀還與分子量和抗散時間有關。抗原含量與環徑的關系有兩種計算方法:

1.Mancini曲線適用于大分子抗原和長時間擴散(>48h)的結果處理。使用方格計算紙劃線,擴散環直徑的平方與抗原濃度呈線性關系(圖12-3)。

利用公式表示:C/d2=K

圖12-3Mancini曲線

T1為1624h;T2為24~48h;T3為48h以上;可見T3為直線,T1為反拋物線

式中C=抗原濃度,d=沉淀環直徑,K=常數

2.Fahey曲線這種曲線適用于小分子抗原和較短時間(24h)擴散的結果處理。使用半對數劃線,濃度的對數與擴散圈直徑之間呈線性關系(圖12-4)。

用公式表示:log/d=K

式中C=抗原濃度(mg/d),d=沉淀環直徑,K=發常數。

各種蛋白質只要符合以下3條,幾乎皆可用SRID定量測定:①備有僅對某待測抗原的單價特異抗血清;②備有已知含量的標準品;③待測品含量在1.25μg/ml以上(單向擴散技術的敏感度)。現在最常用于臨床檢測的項目有IgGIgAIgMC3C4轉鐵蛋白、抗胰蛋白酶、糖蛋白和前白蛋白等多種血漿蛋白

在檢測標本的同時,用已知含量的標準抗原作5~7個稀釋度,同時測量圈的大小(見圖12-2)。按擴散時間(Fahey和Mancini法)的不同,取方格紙或對數紙做標準曲線圖。

單向瓊脂免疫擴散法作為抗原的定量方法,其重復性線性皆是可信賴的,唯敏感度稍差(不能測μg/ml以下含量)。另外,以下影響因素也應注意

1.抗血清不但要求親和力強、特異性好、效價高,而且還應注意存放的方法,防止效價下降。

2.標準曲線測定必須同時制作,決不可一次做成,長期應用。

3.測定時必須同時加測質控血清,以保證測量準確性。

4.有時出現擴散圈呈兩重沉淀環的雙環現象。這是由于出現了不同擴散率、但抗原性相同的兩個組分。例如α重鏈病血清中出現的α重鏈和正常IgA發生反應,就形成內外兩重環(圖12-2)。

圖12-4Fahey曲線

t1為1624h;t2為2448h;t3為48h以上可見t1為直線,t3為拋物線

5.在單向擴散試驗時,有時會出現結果與真實含量不符,這主要出現在Ig測定中。如用單向克隆抗體或用骨髓抗原免疫動物獲得的抗血清,都存在結合價單一的現象,若用此作為單向擴散試劑測量正常人的多態性抗原,則抗體相對過剩,使沉淀圈直徑變小,測量值降低。

6.測得結果的假陽性升高現象與上面相反,如用多克隆抗體測定單克隆病M蛋白),則抗原相對過剩(單一抗原決定簇成分),致使沉淀圈呈不相關的擴大,從而造成某一成分的偽性增加。

6.2 雙向擴散試驗

在瓊脂內抗原和抗體各自向對方擴散,在最恰當的比例處形成抗原抗體沉淀線,觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對比關系,可作出對抗原或抗體的定性分析。雙向擴散也可分為試管法和平板法兩種方法。

6.2.1 (一)試管法

試管法由Oakley首先報道。先在試管中加入含抗體的瓊脂,凝固后在中間加一層普通瓊脂,冷卻后將抗原液體加到上層。放置后,下層的抗體和上層的抗原向中間瓊脂層內自由擴散,在抗原與抗體濃度比例恰當處形成沉淀線。此法分析效果與Oudin法相似,在臨床檢驗中罕用。

6.2.2 (二)平板法

平板法由Ouchterlony首先報道,是抗原抗體鑒定的最基本方法之一。該法的基本步驟是:在瓊脂板上相距3~5mm打一對孔,或者打梅花孔、雙排孔、三角孔等(圖12-5)。在相對的孔中加入抗原或抗體,置室溫或37℃18~24h后,凝膠中各自擴散的抗原和抗體可在濃度比例適當處形成可見的沉淀線。根據沉淀線的形態和位置等可作如下3種分析。

1.抗原或抗體的存在與否及其相對含量的估計沉淀線的形成是根據抗原抗體兩者比例所致。沉淀線如靠近抗原孔,則指示抗體含量較大;如靠近抗體孔,則指示著抗原含量較多。不出現沉淀線則表明抗體或抗原過剩。另外,如出現多條沉淀線,則說明抗原和抗體皆不是單一的成分。因此,可用于鑒定抗原或抗體的純度。

圖12-5雙擴散各種孔型圖

2.抗原或抗體相對分子量的分析抗原或抗體在瓊脂內自由擴散,其速度受分子量的影響。分子量小者擴散快,反之則較慢。由于慢者擴散圈小,局部濃度較大,形成的沉淀線彎向分子量大的一方。如若兩者分子量相等,則形成。圖12-6顯示左側沉淀線抗原分子量大于抗體,右側沉淀線則抗體大于抗原,中間一條線則為兩者相等。抗體多為IgG,分子量約15kD,未知抗原的分子量可做粗略估計。

圖12-6抗原抗體相對分子量示意圖

3.用于抗原性質的分析兩種受檢抗原的性質完全相同、部分相同或完全不同。三種情況在雙向擴散中表現的基本圖形見圖12-7。

從圖12-7可以分析出,左圖中兩種受檢抗原(Ag-a)完全相同,形成一個完全融合的沉淀線;右圖中抗體為雙價,兩種抗原完全不同(Ag-a和Ag-c);中圖的抗體為雙價,兩種抗原(Ag-ab和Ag-ac)皆有相同的a表位,又有不同的b和c表位,所以沉淀線呈部分融合的形狀。這種技術作為抗原的分析,是目前免疫化學中最常用的鑒定技術之一。

圖12-7三種擴散基本圖型

4.用于抗體效價的滴定雙向擴散技術是抗血清抗體效價滴定的常規方法。固定抗原的濃度,稀釋抗體;或者抗原、抗體雙方皆作不同的稀釋,經過自由擴散,形成沉淀線。出現沉淀線的最高抗體稀釋度為該抗體的效價。

7 免疫電泳技術

免疫電泳技術是電泳分析與沉淀反應的結合產物。這種技術有兩大優點,一是加快了沉淀反應的速度,二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開,再分別與抗體反應,以此作更細微的分析。免疫電泳技術的種類很多,這里僅將常用的技術介紹如下。

7.1 免疫電泳

免疫電泳為區帶電泳與免疫雙向擴散的結合,是由Grabar和Williams(1953)首先報道的。方法是先利用區帶電泳技術將不同電荷和分子量的蛋白抗原在瓊脂內分離開,然后與電泳方向平行在兩側開槽,加入抗血清。置室溫或37℃使兩者擴散,各區帶蛋白在相應位置與抗體反應形成弧形沉淀線(圖12-8)。根據各蛋白所處的電泳位置,可分為白蛋白區、球蛋白α1區、α2區、β區和γ區。各區帶常見血漿蛋白見表12-3和圖12-9。

圖12-8免疫電泳擴散模式圖A1b:白蛋白

表12-3血漿免疫電泳各區帶所含蛋白成分

ALB α1 α2 β γ
白蛋白 α1-抗胰蛋白酶 觸珠蛋白 轉鐵蛋白 IgG
前白蛋白 α1-酸糖蛋白 銅藍蛋白 C3a、C3b CRP
α1脂蛋白 糜蛋白酶 2-巨球蛋白 IgA、IgM、IgD纖維蛋白原、β1脂蛋白、血凝素  

圖12-9血漿蛋白各區帶位置示意圖

PreALB:前白蛋白;HP:觸珠蛋白;α1脂蛋白;ALB:白蛋白;TRF:轉鐵蛋白

βLIP:β脂蛋白;AAT:抗胰蛋白酶;AAG:酸糖蛋白;α2M:α2巨球蛋白

免疫電泳沉淀線的數目和分辨率受許多因素影響。首先是抗原與抗體的比例,同其它沉淀反應一樣,要預測抗體與抗原的最適比;其次是抗血清的抗體譜,一只動物的抗血清往往缺乏某些抗體,如將幾只動物或幾種動物的抗血清混合使用,則效果更好;電泳條件,如緩沖液、瓊脂和電泳等皆可直接影響沉淀線的分辨率。對于免疫電泳的分析,更重要的是經驗的積累,只有多看,多對比分析,才能作出恰當的結論。

免疫電泳目前大量應用于純化抗原和抗體成分的分析及正常和異常體液蛋白的識別等方面。

7.2 對流免疫電泳

對流免疫電泳實質上是定向加速度的免疫雙擴散技術,其基本原理是:在瓊脂板上打兩排孔,左側各孔加入待測抗原,右側孔內放入相應抗體,抗原在陰極側,抗體在陽極側。通電后,帶負電荷的抗原泳向陽極抗體側,而抗體藉電滲作用流向陰極抗原側,在兩者之間或抗體的另一側(抗原過量時)形成沉淀線(圖12-10).

圖12-10對流電泳結果示意圖

①Ag為陽性;②Ag為弱陽性;③Ag為強陽性;④Ag為強陽性

IgG作為蛋白質在電泳中比較特殊,4個亞型有不同的表現。G3和G4與一般蛋白無異,泳向陽極;而G1和G2則因其帶電荷少,受電滲的作用力大于電泳,所以被水分子攜裹向陰極移動。這就形成了IgG的特殊電泳形式:一部分泳向陽極,另一部分泳向陰極,在抗體孔兩側皆有抗體存在。因此,所謂對流只是部分IgG的電滲作用造成。

7.3 火箭免疫電泳

火箭免疫電泳技術又稱作單向電泳擴散免疫沉淀試驗,它是由單向擴散發展起來的一項定量技術,實質上是加速度的單向擴散。在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔;加入待測標本后,將抗原置陰極端,用橫距2~3mA/cm的電流強度進行電泳。抗原泳向陽極,在抗原抗體比例恰當處發生結合沉淀。隨著泳動抗原的減少,沉淀逐漸減少,形成峰狀的沉淀區,狀似火箭(圖12-11)。抗體濃度保持不變,峰的高度與抗原量呈正比,用標本中的抗原含量。

圖12-11火箭電泳圖

①②③為標本;④⑤⑥為標準抗原

火箭電泳操作時應注意以下幾點:

1.所用瓊脂可選擇無電滲或電滲很小的,否則火箭形狀不規則。

2.注意電泳終點時間,如火箭電泳頂部呈不清晰的云霧狀或圓形皆提示未達終點。

3.標本數量多時,電泳板應先置電泳槽上,搭橋并開啟電源(電流要小)后再加樣。否則易形成寬底峰形,使定量不準。

4.作IgG定量時,由于抗原和抗體的性質相同,火箭峰因電滲呈紡綞狀。為了糾正這種現象,可用甲醛與IgG上的氨基結合(甲酰化),使本來帶兩性電荷的IgG變為只帶電荷,加快了電泳速度,抵消了電滲作用,而出現伸向陽極的火箭峰。

火箭電泳作為抗原定量只能測定μg/ml以上的含量,如低于此水平則難于形成可見的沉淀峰。加入少量125I標記的標準抗原共同電泳,則可在含抗體的瓊脂中形成不可見的放射自顯影技術。根據自顯影火箭峰降低的程度(競爭法)可計算出抗原的濃度。放射免疫自顯影技術可測出ng/ml的抗原濃度。

7.4 免疫固定電泳

免疫固定電泳(immunofixationelectrophoresis,IFE)是Alper和Johnson(1969)推薦的一項有實用價值的電泳加沉淀反應技術。可用于各種蛋白質的鑒定。該法原理類似免疫電泳,不同之處是將血清直接加于電泳后蛋白質區帶表面,或將浸有抗血清的濾紙貼于其上,抗原與對應抗體直接發生沉淀反應,形成的復合物嵌于固相支持物中。將未結合的游離抗原或抗體洗去,則出現被結合固定的某種蛋白。區帶電泳支持物選用濾紙、醋纖膜、瓊脂或聚丙烯酰胺皆可。

免疫固定電泳最常用于M蛋白的鑒定。方法是:先將患者血清或血漿在醋纖膜上或瓊脂上作區帶電泳(一般作6條標本),達到預定時間后取下,加抗血清,由上而下依次加抗人全血清、抗IgG、抗IgA、抗IgM、抗κ輕鏈和抗λ輕鏈。必要時還可加抗Fab、抗Fc等特殊抗血清。作用30min后洗去游離蛋白質,染色后則可被固定的相應M蛋白成分。

8 免疫濁度法

經典的沉淀試驗有4個缺點無法克服,即操作繁瑣、敏感度低(10~100μg/ml)、時間長和難以自動化。根據抗原與抗體能在液體內快速結合的原理,70年代出現了微量免疫沉淀測定法,即免疫透射濁度測定、免疫膠乳濁度測定和免疫散射濁度測定法。這3種技術皆已常規用于臨床體液蛋白的檢測,并已創造出了多種自動化儀器。

免疫濁度測定的基本原理是:抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復合物,使反應液出現濁度。當反應液中保持抗體過量時,形成的復合物隨抗原量增加而增加,反應液的濁度亦隨之增加,與一系列的標準品對照,即可計算出受檢物的含量。

免疫濁度測定法按照儀器設計的不同可以分為兩種,即比濁儀測定(turbidimetermeasure)和散射比濁儀測定(nephelomitermeasure)。比濁儀測定是測量由于反射吸收或散射引起的入射光衰減,其讀數以吸光度A表示。A什反映了入射光與透射光的比率(A=2-log10T,T代表濁度百分比)。散射比濁儀測定是測量入射光遇到質點(復合物)后呈一定角度散射的光量,該散射光經放大后以散射值表示。兩者的比較見圖12-12。

圖12-12透射光和散射光測定比較

由于免疫復合物的形成有時限變化,當抗原抗體相遇后立即結合成小復合物(<19S),幾分種到幾小時才形成可見的復合物(>19S)。作為快速比濁測定,這種速度太慢,加入聚合劑(或促聚劑)可中速大的免疫復合物形成。目前促聚劑多用聚乙二醇(MW6000~8000),濃度約為4%。

濁度測定亦有其弱點。其一是抗原或抗體量大大過剩時易出現可溶性復合物,造成測定誤差,測定單克隆蛋白時這種更易出現。其二是應維持反應管中抗體蛋白量始終過剩,這個值要預先測定,使儀器的測定范圍在低于生理范圍到高于正常范圍之間;其三是受血脂的影響,尤其是低稀釋度時,脂蛋白的小顆粒可形成濁度,使測定值假性升高。

8.1 免疫膠乳濁度測定法

在上述比濁法中,少量的小的抗原抗體復合物極難形成濁度,除非放置較長時間;如形成較大的復合物,則抗原和抗體用量也較大,顯然不符合微量化的要求。于是發展了免疫膠乳濁度測定,其基本原理是:將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上,當遇到相應抗原時,則使膠乳顆粒發生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波之內不阻礙光線透過,兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過光減少,這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比,當然也與待測抗原量呈正比。見圖12-13。

圖12-13載體膠乳免疫比濁原理

(a)帶抗體的膠乳在波長之內可透過光線;(b)結合后,則形成光線衰減

該技術的關鍵在于兩個方面。首先是選擇適用的膠乳,其大小(直徑)要稍小于波長。用500nm波長者,選擇100nm顆粒較適合;用585nm波長者,則選用100~200nm顆粒為好。目前多用200nm的膠乳顆粒。其次,膠乳與抗體結合時用化學交聯雖好,但失活也較嚴重;一般用吸附法即可。

8.2 免疫速率散射濁度測定法

速率散射比濁法(ratenephelometry)是Sternberg(1977)創建的。光沿水平軸照射時,碰到小顆粒的免疫復合物可導致光散射,散射光的強度與復合物的含量成正比,亦即待測抗原越多,形成的復合物也越多,散射光就越強。

速率散射比濁測定是一種抗原抗體結合的動態測定法。經典的沉淀反應皆在抗原抗體結合完成后進行復合物的定性或定量測定(終點法);若在抗原抗體反應的最高峰(約在1min內)測定其復合物形成的速率(速率法),則可達到快速、準確的目的。

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