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WS/T 503—2017 臨床微生物實驗室血培養操作規范

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目錄

1 拼音

WS/T 503—2017 lín chuáng wēi shēng wù shí yàn shì xuè péi yǎng cāo zuò guī fàn

2 英文參考

Operating procedures of blood culture for clinical microbiology laboratory

3 基本信息

ICS 11.020

C 50

中華人民共和國衛生行業標準 WS/T 503—2017《臨床微生物實驗室血培養操作規范(Operating procedures of blood culture for clinical microbiology laboratory)由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會于2017年09月06日發布,自2018年03月01日起實施。

4 前言

本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。

本標準起草單位:中國醫學科學院北京協和醫院、上海交通大學附屬瑞金醫院、北京醫院、廣東省臨床檢驗中心、北京電力醫院、香港瑪麗醫院。

本標準主要起草人:徐英春、孫宏莉、楊啟文、王瑤、竇紅濤、王賀、趙穎、張麗、范欣、倪語星、胡繼紅、鄒偉民、趙銳、梁皓鈞。

5 標準正文

臨床微生物實驗室血培養操作規范

5.1 1 范圍

本標準規定了血培養臨床微生物檢驗的技術要求。

本標準適用于開展血培養的臨床微生物實驗室。

5.2 2 術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

2.1

一套血培養  one set of blood culture

從同一穿刺點采集的血液標本,通常分別注入需氧和厭氧培養瓶。

2.2

輸液港  access ports

完全植入人體內的閉合輸液裝置,包括尖端位于上腔靜脈的導管部分及埋植于皮下的注射座。

2.3

血培養污染率  rate of blood culture contamination

污染的血培養標本數占同期的血培養標本總數的比例。

計算公式:

血培養污染率 = 污染的血培養標本數 / 同期血培養標本總數 × 100%

5.3 3 血樣采集和培養瓶接種

5.3.1 3.1 采血指征

可疑感染患者出現以下任一指征時,可考慮采集血培養:

a)  體溫>38℃或<36℃;

b) 寒戰

c)  外固血白細胞計數增多(計數>10.0×109/L,特別有“核左移”時)或減少(計數<4.0×109/L);

d)  呼吸頻率>20次/min或動脈二氧化碳分壓(PaCO2)<32 mmHg;

e)  心率>90次/min;

f)  皮膚黏膜出血

g)  昏迷

h) 多器官功能障礙

i)  血壓降低;

j)  炎癥反應參數如C反應蛋白降鈣素原(PCT)、1,3-β-D葡聚糖(G試驗)升高等。

5.3.2 3.2 檢驗申請

申請單應明確標識患者基本信息、申請醫師信息、標本類型、采集部位、申請項目、臨床診斷、采血時間,并盡可能提供其他治療相關信息,如抗菌藥物使用情況。

5.3.3 3.3 采血時間

寒戰或發熱初起時采集。抗菌藥物應用之前采集最佳。

5.3.4 3.4 采集套數

成人每次應采集2套~3套,每套從不同穿刺點進行采集,2 d~5 d內無需重復采集。如懷疑感染性心內膜炎,應重復采集多套。兒童通常僅采集需氧瓶。有以下高危因素時應考慮厭氧瓶培養:其母產褥期腹膜炎,或慢性口腔炎或鼻竇炎蜂窩組織炎、有腹腔感染的癥狀和體癥、咬傷、接受類固醇治療的粒細胞缺乏患兒。考慮肺炎鏈球菌菌血癥時,宜同時做腦脊液培養。

5.3.5 3.5 采血量

成人每瓶采血量8 mL~10 mL,或按照說明書采集;嬰幼兒及兒童采血量不應超過患者總血量的1%,具體采血量參考說明書。若采血量充足,注射器采集的血液先注入厭氧瓶,后注入需氧瓶,碟形針采集的血液反之。若采血量不足,優先注入需氧瓶。

5.3.6 3.6 采集方法

3.6.1 采集靜脈血;僅在評估導管相關性血流感染時采集導管血。血培養宜單獨采血,與其他檢測項目同時采血,應先接種血培養瓶,以避免污染。

3.6.2 采集前做好手衛生,靜脈穿刺點選定后,去除血培養瓶的塑料瓶帽,切勿打開金屬封口環和膠塞,使用75%乙醇或70%異丙醇消毒自然干燥60 s。注意采血前檢查血培養瓶是否完好無損、是否過期。

3.6.3 在穿刺前或穿刺期間,為防止靜脈滑動,應戴無菌乳膠手套固定靜脈。

3.6.4 穿刺點皮膚消毒

a)  三步法:

第一步:75%乙醇擦拭靜脈穿刺部位,待干30 s以上;

第二步:1%~2%碘酊作用30 s或1%碘伏作用60 s,從穿刺點向外畫圈消毒,消毒區域直徑達3 cm以上;

第三步:75%乙醇擦拭碘酊或碘伏消毒過的區域進行脫碘。

對碘過敏的患者,在第一步基礎上再用75%乙醇消毒60 s,待酒精揮發干燥后采血。

b)一步法:

0.5%葡萄糖洗必泰作用30 s(不適用于2個月以內的新生兒),或70%異丙醇消毒后自然干燥(適用于2個月以內的新生兒)。

注意穿刺點消毒后不可再碰觸。

注:其他消毒劑需要進行消毒能力和適用性驗證后才可使用。

3.6.5 用注射器無菌穿刺取血后,勿換針頭(如行第二次穿刺,換針頭),直接注入血培養瓶,不應將抗凝血注入血培養瓶。

3.6.6 血液接種到培養瓶后,輕輕顛倒混勻以防血液凝固

3.6.7  完成工作后洗手。

3.6.8 污染率評估:實驗室應定期對血培養污染率進行評估,污染率應控制在3%以下。

5.4 4 血培養瓶運送

血培養瓶應在2 h之內送至實驗室孵育或上機;如不能及時送檢,應將血培養瓶置于室溫下,切勿冷藏或冷凍。應采用密封的塑料袋和硬質防漏的容器運送標本。若運送到參考實驗室,應使用符合生物安全規定的包裝。

5.5 5 血培養瓶接收

5.1 實驗室收到血培養瓶后,應盡快接收并評估和記錄標本質量(如采集時間、血標本量、瓶數、轉運時間和條件、申請單信息和標識等),評估合格后立即孵育。若培養瓶延遲送檢而提示已有細菌生長,則應直接進行涂片鏡檢。經評估后不合格血培養瓶(如血培養瓶標識錯誤或無標識,破碎,損壞,滲漏,凝血等情況),應拒收并盡快告知申請醫師。

5.2  以下情況可以接收但應告知申請醫師:

a)  采血量不足;

b)  血培養瓶套數或瓶數不夠;

c)  成人樣本僅接種需氧或厭氧瓶。

5.3 特殊情況:實驗室應有緊急預案,如在常規血培養系統故障時,如何對血培養瓶處理和孵育等。

5.6 6 實驗室操作方法及流程

5.6.1 6.1 添加劑

5.6.1.1 6.1.1 抗凝劑

抗凝劑使用聚茴香腦磺酸鈉(SPS),濃度為0.025%~0.05%。肝素檸檬酸鹽和乙二胺四乙酸(EDTA)不能作為抗凝劑加入血培養瓶中,但在檢測分枝桿菌時,也可選用肝素或檸檬酸鹽抗凝。

5.6.1.2 6.1.2 抗生素吸附劑

推薦使用樹脂

5.6.2 6.2 手工培養法

5.6.2.1 6.2.1 培養基
5.6.2.1.1 6.2.1.1 傳統肉湯培養基

傳統肉湯體積應為18 mL~l00 mL。需氧培養基胰酶消化大豆肉湯,腦心浸液肉湯,哥倫比亞肉湯。微需氧或厭氧菌培養需添加硫醇,硫基乙酸鹽;苛養菌培養需添加溶血素、維生素K1和L型半胱氨酸

5.6.2.1.2 6.2.1.2 雙相培養基

同時含有瓊脂和肉湯的血培養瓶,可用于成人或兒童患者的需氧菌、厭氧菌和分枝桿菌培養。血液注入后顛倒培養瓶,使血液和肉湯混合物沖刷瓊脂表面,再將培養瓶垂直孵育,觀察肉湯和瓊脂表面有無微生物生長。

5.6.2.1.3 6.2.1.3 溶血肉湯培養基

使微生物從裂解的血液中釋放出來后,通過離心將其與血液成分分離,沉淀物轉種固體培養基進行孵育。

5.6.2.1.4 6.2.1.4 真菌培養基

應用上述三種培養基都可檢出酵母菌,但雙相真菌和絲狀真菌宜用雙相培養基和溶血肉湯培養基。糠秕馬拉色菌需要在培養基中添加油脂(如橄欖油)。

5.6.2.1.5 6.2.1.5 分枝桿菌培養基

分枝桿菌如在傳統肉湯培養基中延長孵育時間也能生長。在肉湯中添加脂肪酸(如不飽和脂肪酸)、白蛋白和CO2更適合分枝桿菌生長。分枝桿菌中某些種(日內瓦分枝桿菌和嗜血分枝桿菌)生長時需要添加劑(分枝桿菌生長素、溶血素、血紅蛋白或檸檬酸鐵胺)。

5.6.2.2 6.2.2 培養方法
5.6.2.2.1 6.2.2.1 一般情況

推薦35℃~37℃孵育7d,一些緩慢生長的苛養菌(如巴爾通體、李斯特菌屬、布魯菌屬和奴卡菌屬等)和雙相真菌需要更長的孵育時間。手T法應每天或更頻繁地觀察肉眼可見的微生物生長,特別注意孵育48 h內的生長跡象。使用明亮的熒光燈泡或白熾燈,觀察濁度、溶血、產氣、表面菌落形成和血液顏色的改變,發現有微生物生長跡象進行涂片革蘭染色和轉種,根據涂片染色結果選擇培養基類型。

5.6.2.2.2 6.2.2.2 真菌

酵母菌在需氧瓶中易生長,搖動肉湯培養可提高酵母菌的檢出率。多數酵母菌孵育2 d~5 d可檢測出,某些酵母菌如新型隱球菌需延長孵育時間。懷疑雙相真菌或絲狀真菌感染,孵育時間需延長2w~4 w。雙相培養瓶在孵育的最初24 h內,應輕輕搖動。27℃~30℃和35℃~37℃同時孵育。

5.6.2.2.3 6.2.2.3 分枝桿菌

由于分枝桿菌繁殖緩慢,所有培養瓶應至少孵育6w。

5.6.3 6.3  自動化儀器培養法

5.6.3.1 6.3.1 培養基

商品化培養瓶包括需氧瓶、厭氧瓶、兒童瓶、真菌培養瓶及分枝桿菌培養瓶。6.3.2 培養方法

5.6.3.1.1 6.3.2.1 一般情況

35℃~37℃孵育Sd,一些緩慢生長的苛養菌(如巴爾通體、李斯特菌屬和奴卡菌屬等)和雙相真菌需要延長孵育時間。自動化血培養系統每間隔一定時間自動通過電子感應器檢測微生物生長代謝過程中產生的CO2濃度或氣壓變化,陽性報警后需要立即處理。對于已經培養5d的陰性瓶不需要常規盲傳或終點轉種。

5.6.3.1.2 6.3.2.2 真菌

宜采用真菌培養瓶。

5.6.3.1.3 6.3.2.3 分枝桿菌

宜采用分枝桿菌培養瓶。

5.6.4 6.4 室內質控

5.6.4.1 6.4.1 手工培養法

對培養基、革蘭染色、鑒定試劑、藥敏試驗、結果審核和報告解釋等每個項目制訂相應的質控標準操作程序

5.6.4.2 6.4.2 自動化儀器培養法

按廠商推薦的方法進行。

5.7 7 導管相關血流感染

5.7.1 7.1 短期外周導管的血培養

采集2套外周靜脈血培養。無菌操作拔除導管,剪切導管尖端5 cm,采用Maki半定量培養。結果解釋如下:

a)  如1套或以上血培養陽性,并且導管尖端培養陽性(≥15個菌落),血培養與導管尖端培養菌    種相同,提示為導管相關性血流感染(CRBSI);

b)如1套或以上血培養陽性,并且導管尖端培養陰性,無法判斷;但如血培養分離株為金黃色葡萄球菌或念珠菌屬,并且沒有其他明確的感染源,提示為CRBSI;

c)  如2套血培養陰性,但導管培養陽性,提示為導管定植;

d)  如2套血培養和導管尖端培養均為陰性,不考慮CRBSI。

5.7.2 7.2 中心靜脈導管及靜脈輸液港(VAP)的血培養

5.7.2.1 7.2.1 保留導管的患者血培養

至少采集1套靜脈外周血培養,同時應盡快采集等量的1套導管血培養。結果解釋如下:

a)  如2套血培養得到的菌株其鑒定結果和藥敏譜均相同,并且沒有其他明確感染源,提示為    CRBSI。

b) 如2套血培養均陽性并且分離的菌種相同,導管血陽性報警時間比外周血陽性報警時間早≥120 min,又沒有其他明確感染源,則提示為CRBSI(如導管血陽性報警時間比外周血陽性報警時間早<120 min,2套血培養獲得鑒定與藥敏譜相同的分離株,也可能為CRBSI)。

c) 如僅導管血培養陽性,提示導管有細菌定植或污染。

d) 如僅外周血培養陽性,不能確定為CRBSI。若血培養陽性株為金黃色葡萄球菌或念珠菌屬,并且沒有其他明確的感染源,則可能為CRBSI。

e) 如2套血培養均陰性,不考慮CRBSI。

5.7.2.2 7.2.2  擬拔除導管的患者血培養

至少采集1套外周血培養。無菌操作拔除導管,剪切導管尖端5 cm,采用Maki半定量培養。結果解釋如下:

a) 如1套以上血培養和導管尖端培養陽性,并且菌種鑒定與藥敏譜相同,提示為CRBSI。

b) 如1套以上血培養陽性且導管尖端培養陰性,若血培養陽性株為金黃色葡萄球菌或念珠菌屬,

則可能為CRSBI。如需要進行確認,要求進一步采集其他外周血培養,獲得陽性且為同一菌種,沒有其他明確的感染源,提示為CRBSI。

c) 如血培養陰性,導管尖端培養陽性,提示定植。如外周血培養和導管尖端培養均為陰性,不考    慮CRBSI。

5.8 8 感染性心內膜炎

5.8.1 8.1 采集血培養時機及數量

5.8.1.1 8.1.1 急性心內膜炎

應立即采集血培養。宜在經驗用藥前30 min內不同部位采集2~3套血培養。

5.8.1.2 8.1.2 亞急性心內膜炎

宜每隔0.5 h~1 h采集1套血培養,不同部位共采集3套血培養。如24 h培養陰性,宜加做2套血培養。

5.8.2 8.2 假陽性

假陽性最常見的原因是皮膚寄生菌污染。因此可疑感染性心內膜炎患者采集血培養應對采集點皮膚進行徹底消毒,且不應從留置導管處采血,避免出現假陽性結果。

5.8.3 8.3 假陰性

假陰性最常見原因是在采血時患者已使用抗菌藥物,為降低假陰性,宜使用含樹脂的血培養瓶。另一個原因是營養變異鏈球菌(如毗鄰顆粒鏈菌、乏養菌屬)感染。

5.8.4 8.4 孵育時間

常見病原體5 d內培養陽性。如培養5d仍陰性,而臨床懷疑感染性心內膜炎,則應傳種至不含抗菌藥物的巧克力平皿,5% CO2培養。

5.9 9 血培養特殊病原體的處理流程

5.9.1 9.1 乏養菌屬和顆粒鏈菌屬

這類菌在大豆胰蛋白胨血瓊脂平板上不生長,次代培養時要求血培養基中補充吡哆醛或L型半胱氨酸;或同時接種金黃色葡萄球菌,該菌呈“衛星”生長現象;或采用巧克力培養基、厭氧血瓊脂等營養豐富的培養基進行培養。

5.9.2 9.2 巴爾通體

血培養陽性率低,推薦血清學和分子生物學方法檢測。

5.9.3 9.3 布魯菌屬

大多數布魯菌需氧瓶培養3d內陽性,很少超過7d。

5.9.4 9.4 彎曲菌屬

空腸彎曲菌可在血培養中出現,其在傳種后42℃生長較快,微需氧孵育48 h后可看到微小菌落。

5.9.5 9.5 弗朗西斯菌屬

不同菌株生長速度不同,孵育時間不定。由于其菌體微小,形態多樣,革蘭染色易漏檢。土拉熱弗朗西斯菌可在標準血培養瓶中生長,初代培養可在標準羊血瓊脂生長,次代培養不生長。有些菌株初代僅在巧克力瓊脂平板生長。

5.9.6 9.6 HACEK茵群

包括嗜血桿菌屬(H)、放線桿菌屬(A)、心桿菌屬(C)、艾肯菌屬(E)和金氏桿菌屬(K)。多數血培養可在7d內陽性報警。如高度懷疑心內膜炎是由HACEK細菌引起的,而5 d后血培養仍為陰性,應延長培養時間或盲傳。

5.9.7 9.7 螺桿菌屬

螺桿菌屬感染多發生免疫缺陷患者中。血培養瓶通常孵育5d以上,并且在培養結束后,盲傳至血平板,微需氧孵育。

5.9.8 9.8 軍團菌屬

肺炎繼發菌血癥少見,孵育培養5d后,采用溶解離心系統傳種于活性炭酵母浸膏(BCYE)培養基培養。

5.9.9 9.9 鉤端螺旋體

血培養中難分離。

5.9.10 9.10 支原體

人型支原體偶爾可從血培養中分離出來,添加補充明膠精氨酸,可以提高檢出率,生長緩慢并采用專用培養基。可疑肺炎支原體和人型支原體感染血液可以直接接種pH 4.5 SP4葡萄糖培養基。

5.10 10 血培養污染

10.1 即便嚴格遵守無菌操作,仍有3%~5%的血培養瓶中培養出皮膚(如表皮葡萄球菌痤瘡丙酸桿菌、梭菌、類白喉棒狀桿菌)或周圍環境(如不動桿菌屬、芽孢桿菌屬)中常見菌。這些菌大部分為污染菌,但出現以下情況考慮可能為致病菌

a)  不同部位血培養標本培養出同一種菌;

b)多次分離出同一種菌,且藥敏結果相同。

10.2  污染菌不需做藥敏試驗,但應向臨床報告,并提示可能污染,如痤瘡丙酸桿菌(皮膚寄生菌)。

10.3 血培養中兩種或兩種以上細菌生長,可能是復數菌菌血癥,如厭氧菌菌血癥時可能有多種病原菌感染;也可能是污染所致。

5.11 11 血培養報告程序

5.11.1 11.1 血培養陽性報告程序

5.11.1.1 11.1.1 一級報告(初步報告)

血培養陽性,應立即進行涂片和革蘭染色,盡量在1 h內報告給臨床醫師,包括:患者姓名、陽性血

培養瓶類型、瓶數、報警時間、涂片革蘭染色特性及形態,詢問患者目前感染情況和抗菌藥物使用情況并記錄,可向醫師提出治療建議。此外,還應記錄報告時間、接收報告者信息和報告者信息。同時將陽性培養液傳種適當培養基。各單位可根據自身醫療需求,決定是否基于涂片結果用培養液進行直接藥敏試驗。

5.11.1.2 11.1.2 二級報告(補充報告)

將初步鑒定結果及時報告醫師。如進行直接藥敏試驗,應報告藥敏結果。

5.11.1.3 11.1.3 三級報告(終報告)

包括菌種名稱、血培養陽性時間(以小時計算)和標準藥敏試驗結果。

注:隨著微生物快速診斷技術基質輔助激光解吸電藕飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)的應用,菌種鑒定結果有可能在第1天或第2天即可報告。

5.11.2 11.2 血培養陰性報告程序

11.2.1 報告內容:“血培養經××天培養陰性”。自動化儀器細菌培養一般設定周期為5 d,真菌14 d,分枝桿菌42 d;手T法細菌培養一般周期設定為7 d,真菌14 d,分枝桿菌60 d。

11.2.2 可在72 h培養陰性后,發布初步報告,但應說明“培養3d陰性,標本將延長培養至××天,如為陰性可不重復報告”。如72 h后陽性,應按血培養陽性報告程序處理,與臨床溝通并補發陽性報告。

11.2.3 手工法血培養在報告培養陰性前,宜將血培養液盲傳至血瓊脂平板和巧克力平板,于CO2培養箱內孵育24 h,培養陰性后再報告。

5.11.3 11.3 報告審核

實驗室應對陽性血培養涂片口頭報告。應建立初步報告和最終報告的審核制度,并進行定期匯總分析,對實驗室信息系統(LIS)需進行傳輸和性能驗證。實驗室應對以上項目制訂標準操作流程。

5.12 12 血培養安全防護

5.12.1 12.1 安全培訓

對實驗室員工進行安全培訓,應涵蓋所有實驗室活動。實驗室質量保證體系的核心內容應包括培訓、監測事故報告、安全相關文件。

5.12.2 12.2 實驗室感染

針刺傷感染;暴露的皮膚黏膜,接觸氣溶膠或微滴是主要感染途徑。禁止在污染區用嘴吹吸移液管、咬指甲、抽煙、飲食、摘戴隱形眼鏡、手或其他環境表面與眼、鼻、嘴接觸等。

5.12.3 12.3 防護措施

5.12.3.1 12.3.1 洗手

在戴手套前、摘手套后、工作結束后、離開實驗室和進入清潔區時均應洗手。如直接接觸血液或潛在的感染性物質后應立即清洗暴露部位。

5.12.3.2 12.3.2  實驗室生物安全要求

應在二級生物安全實驗室條件下處理標本。疑為高致病性病原體如結核分枝桿菌、布魯菌屬、弗朗西斯菌屬、鼠疫耶爾森菌、類鼻疽博克霍爾德菌等陽性血培養的大量純培養物應在三級生物安全實驗室條件下處理。

5.12.3.3 12.3.3 防護用具
5.12.3.3.1 12.3.3.1 手套

采集血培養、接收和處理標本時應戴手套,采集下一患者時應換手套。血液污染手套、有破損跡象或失去防護作用時應及時更換。

5.12.3.3.2 12.3.3.2  面罩

實驗室人員暴露于可經空氣傳播的高危險性物質或可能發生標本噴濺時,應配戴個人防護面罩。

5.12.3.3.3 12.3.3.3  隔離服

應穿隔離服,存在任何可見污染時立即脫去,并作為生物危險垃圾丟棄或嚴格按流程清洗。離開實驗室或進入清潔區時應脫去隔離服。

5.12.4 12.4 防護針刺傷

12.4.1 盡可能減少注射器及銳器的使用。

12.4.2 使用注射器時,應避免回套針帽。

12.4.3 若用注射器采集血液,將血液直接注入血培養瓶,無需更換針頭。注射器使用完畢后,應將針頭放入銳器桶,不可重復使用。

12.4.4 使用后的注射器或其他銳器,應裝入銳器桶內。

12.5  溢灑處理

12.5.1 若溢灑的感染性物質可經呼吸道傳播,溢灑處的房間應關閉至少30 min以使微滴沉降。在清理溢灑時應戴個人防護用具。溢灑物含高危病原體(如結核分枝桿菌)時,應戴N95口罩。

12.5.2 根據溢灑物的量、類型、可能含有的傳染性物質及其濃度和污染表面的類型,制定實驗室具體處理措施。至少應包括以下要素

a) 容器及吸收物質;

b) 用水溶性清潔劑去除殘留的溢灑物;

c) 用快速醫用消毒劑如自制的漂白劑稀釋液沖洗表面污染,濃度和作用時間取決于污染表面的類型;

d) 擦去消毒劑并用水擦洗;

e) 表面干燥防止滑倒;

f) 去污染用的材料、所有被污染且不能有效去污染的物質均應處理。

5.13 13 菌株保存

血培養陽性菌株應保存并符合生物安全要求,以備復核或進一步檢測。

6 參考文獻

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[8] 國家衛生和計劃生育委員會:臨床檢驗專業醫療質量控質指標(2015年版).

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