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WS/T 497—2017 侵襲性真菌病臨床實驗室診斷操作指南

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目錄

1 拼音

WS/T 497—2017 qīn xí xìng zhēn jūn bìng lín chuáng shí yàn shì zhěn duàn cāo zuò zhǐ nán

2 英文參考

Performance guideline for clinical laboratory diagnosis of invasive fungal diseases

3 基本信息

ICS 11.020

C 50

中華人民共和國衛生行業標準 WS/T 497—2017侵襲性真菌病臨床實驗室診斷操作指南》(Performance guideline for clinical laboratory diagnosis of invasive fungal diseases)由中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會于2017年01月15日發布,自2017年07月01日起實施。

4 發布通知

關于發布《臨床實驗室質量指標》等5項推薦性衛生行業標準的通告

國衛通〔2017〕1號

現發布《臨床實驗室質量指標》等5項推薦性衛生行業標準,其編號和名稱如下:

WS/T 496—2017臨床實驗室質量指標

WS/T 497—2017侵襲性真菌病臨床實驗室診斷操作指南

WS/T 498—2017細菌性腹瀉臨床實驗室診斷操作指南

WS/T 499—2017下呼吸道感染細菌培養操作指南

WS/T 514—2017臨床檢驗方法檢出能力的確立和驗證

上述標準自2017年7月1日起施行。

特此通告。

國家衛生計生委

2017年1月25日

5 前言

本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。

本標準起草單位:中國醫學科學院北京協和醫院、北京大學第一醫院、復旦大學附屬華山醫院。本標準起草人:徐英春、李若瑜、章強強、王瑤、王賀、余進、郭莉娜、張麗、范欣。

6 全文

侵襲性真菌病臨床實驗室診斷操作指南

6.1 1 范圍

本標準規定了侵襲性真菌病臨床實驗室診斷操作指南,包括標本采集處理、形態檢查真菌培養、培養診斷、非培養診斷和藥物敏感試驗

本標準適用于具有Ⅱ級生物安全防護能力的臨床實驗室。

6.2 2 術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

2.1

侵襲性真菌病  invasive fungal disease;IFD

真菌侵入人體組織血液,并在其中生長繁殖所致組織損害、器官功能障礙、炎癥反應的病理改變及病理生理過程。根據患者宿主因素、臨床特征和微生物學檢查、將IFD診斷分為確診、擬診和疑似。

2.2

最小抑菌濃度  minimum inhibitory concentration;MIC

按照標準操作規程進行體外真菌稀釋法或連續濃度梯度稀釋法藥物敏感試驗時,在特定培養時間及溫度的條件下,能導致特定程度肉眼可見真菌生長抑制的最低藥物濃度。

2.3

劑量依賴敏感  susceptible dose dependent;SDD

MIC為劑量依賴敏感時,給予高于常規給藥劑量且達到最大血藥濃度時,臨床治療有效。

2.4

最低有效濃度  minimum effective concentration;MEC

曲霉在含系列濃度的棘白菌素類藥物的培養基中培養時,與生長對照孔中的菌絲形態相比,菌絲變短、變網、變粗的最低藥物濃度。

2.5

折點  breakpoint

臨床上將抗菌藥物對真菌分為敏感、耐藥中介或劑量依賴敏感的特定MIC值。折點系綜合體外的MIC值、耐藥機制、抗菌藥物PK/PD參數及臨床療效而得出,還可能隨環境改變而改變(如感染部位、常規給藥劑量的改變、給藥途徑及頻次的改變)。

2.6

消化液  lysis solution

用于呼吸道標本等的前處理的化學試劑,起粘液溶解作用,常用N-乙酰-L-半胱氨酸、5%草酸或二巰基蘇糖醇等。

6.3 3 標本采集及處理

6.3.1 3.1 血液標本采集和處理

6.3.1.1 3.1.1 采集部位消毒

3.1.1.1  一步法:葡萄糖酸氯己啶作用30s,或70%異丙醇消毒自然干燥

3.1.1.2 三步法:

a) 70%乙醇擦拭靜脈穿刺部位,作用30s以上、待干;

b)1%~2%碘酊從穿刺點向外畫圈消毒至消毒區域直徑>3cm,作用30s或10%碘伏作用60s:

c)70%乙醇脫碘:對碘過敏者,用70%乙醇消毒60 s,待乙醇揮發干燥、采集標本。

6.3.1.2 3.1.2  標本采集

宜在抗真菌藥物使用前,發熱初期或寒顫期采靜脈血。采集后立即注入血培養瓶內并輕輕搖勻。至少采集2套。標本與培養基比例為1/10~1/5(成人每瓶8 mL~10 mL),應包括需氧瓶或真菌瓶。

6.3.1.3 3.1.3  標本處理

2h內常溫送檢。若不能及時送檢,則常溫保存評估導管相關性血流感染CRBSI)時,如患者已拔管,應采集2套外周血進行培養,同時做導管尖Maki法半定量培養(導管尖長5cm),如1套及以上外周血培養陽性,導管尖培養陽性(≥15 CFU),且血培養與導管尖培養菌種相同,即為CRBSI。如患者尚未拔管,應至少采集1套外周血培養,同時盡快采集等量的導管血進行培養,如導管血與外周血培養均陽性,導管血陽性時間比外周血早2h,或導管血中菌量為外周血中菌量5倍以上,且沒有其他明確感染源,即為CRBSI;如導管血培養陰性,外周血培養陽性且為念珠菌屬,且沒有其他明確感染源,也可能為CRBSI。

6.3.2 3.2  骨髓標本采集和處理

6.3.2.1 3.2.1  標本采集

使用肝素化的注射器或溶解離心管采集骨髓液0.5 mL(兒童)至3 mL(成人)后送檢。

6.3.2.2 3.2.2  標本處理

15 min內常溫送檢。若不能及時送檢,則常溫保存。不宜常規做骨髓液培養,如需培養可將骨髓液接種于培養瓶,但易出現假陽性。骨髓液需同時做吉姆薩染色鏡檢。

6.3.3 3.3  靜脈導管標本采集和處理

6.3.3.1 3.3.1  標本采集

剪取導管尖段5 cm置于無菌容器中送檢。

6.3.3.2 3.3.2  標本處理

15 min內常溫送檢。若不能及時送檢,則4℃保存。將導管置于血平板上,使用無菌鑷子將其從平板一端滾動至另一端,滾動4次,做導管尖Maki法半定量培養。不應使用含放線菌酮的培養基。

6.3.4 3.4  無菌體液(腦脊液、心包液、腹水和關節液)標本采集和處理

6.3.4.1 3.4.1  標本采集

腦脊液使用脊髓穿刺針采取后送檢。其余的無菌體液使用含肝素的無菌真空采血管采集。3.4.2  標本處理

15 min內常溫送檢。若不能及時送檢,則常溫保存(不能冷藏)。標本大于2 mL,則2000 g離心10 min,取沉渣接種。若標本量少于2 mL,則將標本直接接種于培養基。宜使用細胞離心機對無菌體液進行涂片鏡檢。腦脊液可直接接種于血培養瓶。

6.3.5 3.5 膿液、引流液、創面分泌物及竇道

6.3.5.1 3.5.1 標本采集

3.5.1.1  開放性創口:用無菌生理鹽水沖洗創面后,應采集病灶活動性邊緣組織標本。3.5.1.2  封閉性膿腫:局部皮膚消毒后用注射器抽取膿血性液體送檢。

6.3.5.2 3.5.2  標本處理

2h內常溫送檢。將標本直接接種于培養基。較濃稠的標本應使用消化液處理。

6.3.6 3.6 下呼吸道標本(深部痰液、支氣管吸取物、肺泡灌洗液)采集和處理

6.3.6.1 3.6.1  標本采集

清潔口腔后采集清晨第一口痰液。采用外科方法進行支氣管毛刷取樣和采集肺泡洗液唾液或24 h痰液都不能用于真菌培養。

6.3.6.2 3.6.2  標本處理

2h內室溫送檢;若不能及時送檢,則4℃保存。將標本接種至含抗生素的選擇培養基中。較黏稠的下呼吸道標本應使用消化液處理,并2000 g離心10 min后取沉渣接種。

6.3.7 3.7 眼(角膜刮片、玻璃體液等)標本采集和處理

6.3.7.1 3.7.1  標本采集

角膜刮片或針吸玻璃體液。

6.3.7.2 3.7.2  標本處理

15 min內常溫送檢。若不能及時送檢,則常溫保存。角膜刮取標本直接接種至不含抑制劑的培養皿中,采用X或C型涂菌方式,玻璃體液離心后取沉淀物接種。

6.3.8 3.8 組織標本采集和處理

6.3.8.1 3.8.1  標本采集

采集標本后使用無菌容器轉運,如標本量較少,應滴數滴無菌鹽水保濕。

6.3.8.2 3.8.2  標本處理

及時送檢,否則應室溫保存。采用滅菌眼科剪將組織標本剪成米粒大小后接種培養;若可疑組織胞漿菌感染、研磨組織并培養,或采用裂解離心技術處理。若可疑接合菌感染、不研磨組織直接接種。直接鏡檢應研磨組織,但會影響絲狀真菌培養陽性率。建議病理科與檢驗科聯合檢查組織標本。

6.3.9 3.9 尿液標本采集和處理

6.3.9.1 3.9.1  標本采集

采集早晨第一次清潔尿液恥骨上聯合穿刺尿液或導管尿液10 mL~50 mL,不應采用24 h尿液。

6.3.9.2 3.9.2  標本處理

2h內常溫送檢;若不能及時送檢,則4℃保存。尿液接種前應2000 g離心10 min,取沉渣進行鏡檢和接種。尿液真菌培養不宜定量檢測

6.3.10 3.10 不合格標本

下列情況為不合格標本:

a)  標本標識與申請單不符,標識錯誤或無標識;

b)  未采用無菌容器或容器選擇不恰當;

c)  標本采集未按規定消毒或清潔創口;

d)  標本采集量過少;

e)  標本保存方式不恰當或保存時間超過規定;

f)  血培養瓶破碎、滲漏或超過有效期

g)  稀薄唾液或低倍鏡下上皮細胞數大于10個;

h)  尿液采集未清洗會陰部及尿道口。

6.4 4 標本形態檢查

6.4.1 4.1 標本處理

陽性血培養標本、呼吸道標本、膿液及創面分泌物可直接涂片;尿液、腦脊液和其他無菌體液等應離心后鏡檢。處理材料為10%氫氧化鉀、墨汁、無菌生理鹽水。

6.4.2 4.2 操作步驟

標本滴加載浮液后,加蓋玻片鏡檢。先用低倍鏡(遮去強光)觀察有無菌絲和孢子然后用高倍鏡觀察孢子和菌絲的形態、位置、大小和排列、產孢結構等特征。

觀察到以下形態提示真菌種屬:

a)  酵母樣孢子:提示酵母菌

b)  酵母樣孢子和假菌絲:提示念珠菌屬;

c)  有莢膜的酵母樣孢子:提示隱球菌

d)  透明、有隔菌絲,呈45°分支鹿角樣:提示曲霉屬;

e)  透明、無隔或少隔菌絲,菌絲寬大,呈90°分支:提示接合菌綱真菌;

f)  棕色或黑色菌絲或孢子:提示暗色絲狀真菌。

6.4.3 4.3 結果解釋

無菌部位取材標本涂片陽性提示真菌感染可能。非無菌部位取材標本涂片陽性時應結合臨床其他檢查。真菌菌絲、孢子或芽孢有一定折光性,勿將纖維、細胞等判為真菌。

6.5 5 真菌培養

6.5.1 5.1 培養基

沙保弱葡萄糖瓊脂馬鈴薯瓊脂、腦心浸膏瓊脂等,有條件實驗室平行接種顯色培養基;培養基中可加入氯霉素慶大霉素

6.5.2 5.2 操作步驟

宜采用螺口管斜面培養法:標本處理后接種于培養基斜面中下部,封口,建議平行接種兩管。平板培養:三區劃線接種,每平板只能接種一份標本。

6.5.3 5.3 培養條件

通常28℃±1℃培養7d,如懷疑雙相真菌(如馬內菲青霉)感染,應同時在28℃+1℃及35℃±1℃培養。對于組織、腦脊液等標本,或懷疑罕見真菌或慢生長真菌(如莢膜組織胞漿菌、隱球菌)感染時,建議至少培養1個月。

6.6 6 培養診斷

6.6.1 6.1 培養鑒定流程

6.1.1 真菌培養鑒定流程見圖1。

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圖1  真菌培養鑒定流程

6.1.2  判斷有無臨床意義:在嚴格的防污染下,組織標本及無菌體液標本中有任何真菌生長都有意義。非無菌標本,兩個試管有同一形態真菌生長,真菌鏡檢同時陽性者提示可能有臨床意義;僅一管生長,生長部位為非接種部位,菌落霉菌樣則可能是污染。

6.1.3  菌株是否為致病菌應結合標本直接鏡檢結果、患者臨床癥狀體征、影像學及其他檢查結果綜合分析

6.6.2 6.2 真菌培養物形態學鑒定

6.6.2.1 6.2.1 原理

通過菌落形態以及顯微鏡下真菌孢子、菌絲、產孢等特征性結構進行初步判斷真菌種屬。

6.6.2.2 6.2.2  材料

光學顯微鏡、透明膠帶、載玻片、乳酸酚棉藍、無菌生理鹽水、蓋玻片等。

6.6.2.3 6.2.3  操作步驟

觀察菌落形態及鏡下形態。絲狀真菌鏡下形態觀察通常采用透明膠帶法。利用膠帶粘一定量菌絲,再粘在預先滴加乳酸酚棉藍的載玻片上,顯微鏡下觀察孢子和菌絲的形態、特征、大小和排列等。酵母菌鏡下觀察采用生理鹽水涂片法。

6.6.3 6.3 芽管形成試驗

6.6.3.1 6.3.1  原理

白念珠菌可形成芽管,其他念珠菌一般不形成芽管,因此用于白念珠菌的鑒定。

6.6.3.2 6.3.2  材料

血清、蓋玻片、平皿、光學顯微鏡等。

6.6.3.3 6.3.3  操作步驟

將念珠菌接種于0.2 mL~0.5 mL人或動物血清中,37℃孵育1.5 h~4 h,鏡檢觀察有無芽管形成。需設立陽性對照(白念珠菌)和陰性對照(熱帶念珠菌),注意熱帶念珠菌在血清中孵育6h或更久也可形成芽管。

6.6.4 6.4 小培養形態學鑒定

6.6.4.1 6.4.1  原理

顯微鏡下觀察菌落的自然生長和產孢狀態,利于發現真菌特征性表現,一般用于絲狀真菌鑒定。

6.6.4.2 6.4.2  標本

真菌分純培養菌株。

6.6.4.3 6.4.3  材料

載玻片、蓋玻片、滅菌器、鑷子、V型或U型玻璃棒、無菌空平皿、馬鈴薯瓊脂培養基、紗布或棉花、刀片等。

6.6.4.4 6.4.4  操作步驟(瓊脂塊法)

將刀片消毒,在馬鈴薯瓊脂培養基上切一小塊約0.5 cm2的瓊脂塊,放在滅菌載玻片上;用接種針挑取待測菌株的少量菌絲(肉眼可見即可),分別接種在瓊脂塊的四角位置;將滅菌后的蓋玻片置于瓊脂塊表面;在無菌平皿中放入無菌的玻璃棒(或其他支持物),加適量無菌水或含水棉球、紗布,將載玻片放入無菌平皿的支持物上,蓋上蓋玻片;28℃±1℃培養,每天觀察至產孢良好或菌絲豐富時,提起蓋玻片,移去瓊脂塊,分別將蓋玻片和載玻片制片,顯微鏡觀察。

6.6.5 6.5 顯色培養基鑒定

6.6.5.1 6.5.1  原理

念珠菌自身代謝產生的酶與相應顯色底物反應,釋放出顯色基團,從而使菌落呈現不同顏色。

6.6.5.2 6.5.2  標本

可疑念珠菌屬的菌株或懷疑念珠菌屬感染的臨床標本。

6.6.5.3 6.5.3  材料

念珠菌顯色培養基。

6.6.5.4 6.5.4 操作步驟

將可疑菌株或臨床標本接種于顯色瓊脂,30℃~37℃培養48 h,觀察菌落顏色變化。

6.6.5.5 6.5.5  質控

白念珠菌標準菌株或參考菌株。

6.6.5.6 6.5.6  結果解釋

以科瑪嘉顯色培養基為例,綠色菌落提示白念珠菌;藍灰色或者鐵藍色菌落提示熱帶念珠菌;粉紅色,邊緣模糊有微毛刺菌落提示克柔念珠菌;中央為紫色的菌落提示光滑念珠菌;白色菌落提示其他念珠菌。其他顯色培養基參考生產廠家說明。

6.6.5.7 6.5.7  注意

對于顯色不典型及臨床少見念珠菌鑒定不準確。顯色培養基鑒定結果僅供參考,應以質譜、分子生物學等鑒定方法為準。

6.6.6 6.6 生化方法鑒定

根據不同種屬微生物理化性質不同,利用不同生化反應鑒別或鑒定微生物種屬。常用方法包括手工生化鑒定法和全自動生化鑒定法。

6.6.7 6.7 基于核酸分子生物學鑒定

基因測序應用較多,常用基因為真菌內轉錄間隔區(ITS區)、28S rDNA、延長因子,β微管蛋白,鈣調蛋白等,不同種屬所選基因不同。所得序列需要與兩個或兩個以上真菌基因數據庫比對,得到可靠鑒定結果。

6.6.8 6.8 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)鑒定

通過檢測獲得微生物的蛋白質譜圖,并將所得的譜圖與數據庫中的真菌參考譜圖比對后得出鑒定結果。

6.6.9 6.9 報告解釋

6.6.9.1 6.9.1 培養陽性

無菌部位標本報告實際培養結果。非無菌部位標本培養如陽性,菌株是否為致病菌應結合標本直接鏡檢結果和患者臨床癥狀體征、影像學及其他檢查結果綜合分析,并以此為依據判斷是否需要對該菌株進行藥敏試驗

6.6.9.2 6.9.2 培養陰性

6.9.2.1  初步報告

培養7d無真菌生長,可發初步陰性報告“培養7d無真菌生長”。

6.9.2.2  終報告

初步陰性報告后,每周觀察,根據最終培養時間發出終報告“培養××周無真菌生長”。

6.7 7 非培養診斷

6.7.1 7.1 1,3-β-D-葡聚糖檢測(G試驗)

6.7.1.1 7.1.1  原理

侵襲性真菌感染時真菌生長釋放出可溶性細胞壁成分1,3-β-D葡聚糖,可與鱟試驗中G因子發生級聯反應,從而通過動態比濁法或動態比色法,檢測標本中葡聚糖含量。

6.7.1.2 7.1.2  標本

血漿或血清。

6.7.1.3 7.1.3  注意

可檢測除隱球菌、接合菌之外,臨床絕大多數的侵襲性真菌感染,包括念珠菌、曲霉、肺孢子菌等。結果解讀時應注意患者是否存在導致假陽性的因素,如血液透析腹膜透析乳糜血、棉花制品、免疫球蛋白蘑菇多糖膽固醇過高或內毒素等多種原因均會出現假陽性。推薦每周檢測兩次或依病情而定。

6.7.2 7.2 半乳甘露聚糖檢測(GM試驗)

6.7.2.1 7.2.1  原理

半乳甘露聚糖是曲霉特異性細胞壁成分,由菌絲在組織中生長時釋放出來,GM試驗利用雙抗體夾心法或競爭法,與半乳甘露聚糖的1,5-β-D-呋喃半乳糖苷側鏈結合,檢測標本中半乳甘露聚糖含量。

6.7.2.2 7.2.2  標本

血清、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液等標本。

6.7.2.3 7.2.3  注意

無菌密閉容器收集。曲霉菌感染檢測特異性較高,但多種原因可導致假陽性。出現假陽性的常見原因:青霉、隱球菌感染;消化道定植或食物中的曲霉污染;大劑量使用激素透析等。推薦每周檢測2次或依病情而定。

6.7.3 7.3 隱球菌抗原檢測

7.3.1  原理:利用乳膠凝集法和酶聯免疫吸附測定方法檢測樣本中是否含有隱球菌莢膜多糖抗原

7.3.2  標本:腦脊液、血清。

7.3.3  注意:乳膠凝集法,血清中含有類風濕因子、標本中含瓊脂凝固劑、二氧化碳嗜纖維菌感染、白吉利毛孢子菌感染、羥乙基淀粉、血清中含>200 mg的Fe3+/dL、HIV感染者非特異性反應、反應玻片的不正確清洗等可導致假陽性;感染早期、莢膜抗原濃度低、血清中含有免疫復合物、莢膜抗原濃度高引起的前帶效應、抗原分泌量少等可導致假陰性ELISA法,其他微生物感染如毛孢子菌屬感染可導致假陽性;感染早期、莢膜抗原濃度低、血清中含免疫復合物、抗原分泌量少等可導致假陰性。

7.3.4  血清或腦脊液滴度≤1:4的陽性反應結果,高度懷疑隱球菌感染;滴度≥1:8則認為患有隱球菌病

6.7.4 7.4 標本核酸直接檢測

在有資質的臨床微生物分子診斷實驗室可利用標本直接進行核酸擴增檢測病原真菌。其臨床報告應遵從國內分子檢測相關規程,并進行嚴格的質量控制

6.8 8 藥物敏感試驗

6.8.1 8.1 微量肉湯稀釋法

6.8.1.1 8.1.1 原理

將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到無菌微孔板中,與一定量的真菌在特定的培養時間及培養溫度下共同孵育,讀取能完全或顯著抑制真菌生長的最低藥物濃度。

6.8.1.2 8.1.2 培養基

RPMI1640培養基,含谷氨酰胺不含碳酸氫鹽并以酚紅指示劑,使用0.165 mol/L 3-(N嗎啉基)丙磺酸(MOPS)緩沖液調pH 7.0±0.1(室溫)。

6.8.1.3 8.1.3 適用菌種

酵母菌、絲狀真菌。

6.8.1.4 8.1.4 檢測藥物

氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑兩性霉素B氟胞嘧啶、卡泊芬凈、米卡芬凈等。

6.8.1.5 8.1.5 酵母茵結果判讀

8.1.5.1  判讀標準

與生長對照孔相比,兩性霉素B讀取100%抑制時的MIC值;氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶、卡泊芬凈、米卡芬凈讀取50%抑制時的MIC值。

8.1.5.2  判定折點

CLSI M27-S4規定的部分念珠菌微量肉湯稀釋法藥敏試驗判定折點見表1,其他酵母菌尚未建立臨床折點。

表1  念珠茵微量肉湯稀釋法藥敏試驗唑類藥物(孵育24 h)和棘白菌素類藥物判定折點

抗菌藥物

菌種

S

μg/mL

SDDa

μg/mL

Ib

μg/mL

R

μg/mL

氟康唑c

白念珠菌

≤2

4


≥8

光滑念珠菌

≤32

≥64

克柔念珠菌

近平滑念珠菌

≤2

4


≥8

熱帶念珠菌

≤2

4

≥8

伏立康唑d,e

白念珠菌

≤0.12

0.25~0.5


≥1

光滑念珠菌

克柔念珠菌

≤0.5

1

≥2

近平滑念珠菌

≤0.12

0.25~0.5


≥1

熱帶念珠菌

≤0.12

0.25~0.5

≥1

卡泊芬凈d,f

白念珠菌

≤0.25


0.5

≥1

光滑念珠菌

≤0.12

0.25

≥0.5

熱帶念珠菌

≤0.25

0.5

≥1

克柔念珠菌

≤0.25


0.5

≥1

近平滑念珠菌

≤2

4

≥8

季也蒙念珠菌

≤2


4

≥8

米卡芬凈d

白念珠菌

≤0.25

0.5

≥1

光滑念珠菌g

≤0.06

0.12

≥0.25

熱帶念珠菌

≤0.25


0.5

≥1

克柔念珠菌

≤0.25

0.5

≥1

近平滑念珠菌

≤2


4

≥8

季也蒙念珠菌

≤2

4

≥8

注:S:敏感;SDD:劑量依賴敏感;I:中介;R:耐藥。

aSDD:敏感性取決于最大的血液藥物濃度水平。對氟康唑,腎功能和基礎情況正常的成人需要給予超過標準劑量(6mg·kg/d)或更高劑量治療。

b中介:現有數據不能明確的判定為敏感或耐藥。

c氟康唑折點的制定是根據大量的粘膜及侵襲性念珠菌感染者制定的。對光滑念珠菌,MIC≤32時應該給予最大劑量的氟康唑治療。

d數據主要來源于非中性粒細胞缺乏的念珠菌血癥患者。

e日前的數據還不足以說明光滑念珠菌對伏立康唑體外藥敏試驗結果與臨床療效、預后的關系。

f卡泊芬凈敏感性試驗結果會兇不同的試驗方法而有較大可變性

g光滑念珠菌對米卡芬凈的MIC值相比較其他棘白菌素類藥物稍低,但并不意味著米卡芬凈對光滑念珠菌的活性更強。

6.8.1.6 8.1.6  絲狀真菌結果判讀

8.1.6.1  判讀標準

與生長對照孔相比,兩性霉素B、伊曲康唑、伏立康唑讀取菌株生長100%抑制時的MIC值;氟康唑、氟胞嘧啶讀取50%抑制時的MIC值;曲霉對棘白菌素類藥敏試驗讀MEC值,即與生長對照孔相比,出現小的、圓的、緊湊的菌絲相時的藥物濃度。

8.1.6.2  判定折點

CLSI尚未確定絲狀真菌的藥敏試驗臨床折點。

6.8.1.7 8.1.7  質控菌株及參考范圍

質控菌株的微量肉湯稀釋法24 h和48 h MIC質控范圍見表2。

表2  質控菌株的微量肉湯稀釋法24 h和48 h MIC質控范圍

藥物

近平滑念珠菌ATCC22019

克柔念珠菌ATCC6528

24h MIC范圍

μg/mL

48 h MIC范圍

μg/mL

24 h MIC范圍

μg/mL

48 h MIC范圍

μg/mL

兩性霉素B

0.25~2.0

0.5~4.0

0.5~2.0

1.0~4.0

阿尼芬凈

0.25~2.0

0.5~2.0

0.03~0.12

0.03~0.12

卡泊芬凈

0.25~1.0

0.5~4.0

0.12~1.0

0.25~1.0

5-氟胞嘧啶

0.06~0.25

0.12~0.5

4.0~16

8.0~32

氟康唑

0.5~4

1.0~4.0

8.0~64

16~128

伊曲康唑

0.12~0.5

0.12~0.5

0.12~1.0

0.25~1.0

酮康唑

0.03~0.25

0.06~0.5

0.12~1.0

0.25~1.0

米卡芬凈

0.5~2

0.5~4

0.12~0.5

0.12~0.5

泊沙康唑

0.06~0.25

0.06~0.25

0.06~0.5

0.12~1.0

里氟康唑

0.016~0.12

0.03~0.25

0.06~0.5

0.25~1.0

伏立康唑

0.016~0.12

0.03~0.25

0.06~0.5

0.12~1.0

6.8.2 8.2 改良微量肉湯稀釋法

6.8.2.1 8.2.1  原理

在半固體培養基中檢測抗真菌藥物敏感性,與生長對照比,通過生長濁度判定MIC值。

6.8.2.2 8.2.2  適用菌種

念珠菌屬、新型隱球菌。

6.8.2.3 8.2.3  檢測藥物

氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、氟胞嘧啶、兩性霉素B。

6.8.2.4 8.2.4  注意

唑類藥物存在“拖尾”現象,易將藥敏結果判讀為假耐藥。

6.8.3 8.3 濃度梯度稀釋法

6.8.3.1 8.3.1  培養基

RPMI 1640+MOPS+2%葡萄糖+1.5%瓊脂。

6.8.3.2 8.3.2  適用菌種

酵母菌、曲霉菌、鐮刀菌、根霉屬

6.8.3.3 8.3.3 檢測藥物

兩性霉素B、氟胞嘧啶、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈。

6.8.4 8.4 紙片擴散法

6.8.4.1 8.4.1  培養基

改良Shadomy培養基。

6.8.4.2 8.4.2  適用菌種

酵母菌。

6.8.4.3 8.4.3  檢測藥物

氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑、酮康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶、卡泊芬凈(直徑為9mm藥敏紙片)。

6.8.4.4 8.4.4  結果判讀

8.4.4.1  判讀標準

兩性霉素B:生長完全抑制的最小藥物濃度;三唑類、咪唑類、卡泊芬凈:量取至有正常大小菌落生長的抑菌環直徑的大小。

8.4.4.2  注意

不能隨意更改培養基、紙片大小、含量等,否則將導致假耐藥。

8.4.4.3  判定折點

參考CLSI M44-A2制定的折點,見表3。

表3  酵母菌紙片擴散法藥敏試驗判定折點

抗菌藥物

含量

μg

S

mm

SDD

mm

I

mm

R

mm

氟康唑

25

≥22

21~15

≤14

伏立康唑

1

≥17

16~14


≤13

抗菌藥物

含量

μg

S

mm

SDD

mm

I

mm

R

mm

伊曲康唑

8

≥23

22~14


≤13

酮康唑

15

≥30

29~23

≤22

兩性霉素B

10

≥15

14~10

≤9

氟胞嘧啶

1

≥20


19~12

≤11

卡泊芬凈

5

≥1I

≤10

注:SDD:劑量依賴敏感;S:敏感;I:中介;R:耐藥。

6.8.4.5 8.4.5  紙片擴散法質控菌株及允許范圍

紙片擴散法質控菌株及允許范圍見表4。

表4 紙片擴散法質控菌株及允許范圍(僅限于改良Shadomy培養基)

抗菌藥物

白念珠菌ATCC 64548

mm

近平滑念珠菌ATCC 22019

mm

克柔念珠菌ATCC 6258

mm

氟康唑

36~42

30~36

10~16

伏立康唑

31~42

28~37

16~25

伊曲康唑

25~31

28~35

16~22

酮康唑

36~44

41~49

20~26

兩性霉素B

18~23

20~26

17~23

氟胞嘧啶

34~40

35~43

9

卡泊芬凈

15~22

13~23

15~22

6.9 參考文獻

[1] 秦啟賢.臨床真菌學.上海:復旦大學出版社,2001.

[2]  王端禮,醫學真菌學—實驗室檢驗規范.北京:人民衛生出版社,2005.

[3]  吳紹熙.現代醫學真菌檢驗手冊.(2版).北京:中國協和醫科大學出版社,2005.

[4]  周庭銀,倪語星.臨床微生物檢驗標準化操作.上海:上海科學技術出版社,2009.

[5]  周庭銀.臨床微生物學診斷與圖解.(3版).上海:上海科學技術出版社,2012.

[6]  WS/T 421—2013  抗酵母樣真菌藥物敏感性試驗肉湯稀釋法

[7]  WS/T 411—2013  抗絲狀真菌藥物敏感性試驗肉湯稀釋法

[8]   James V. Manual of Clinical Microbiology[M].10th ed. Washington,DC: ASM Press,2011.

[9]    Sybren de Hoog,Guarro J,Gene J,et al. Atlas of clinical fungi [M]. CBS, Electronic Version 3.1,2011.

[10]    CLSI.Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal  Susceptibility  Testing  of  Yeasts,2009,M27-A3, vol.28, No14.

[11]    CLSI.Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal  Susceptibility  Testing  of  Yeasts,2012,M27-S4, vol.28,No15.

[12]  CLSI.Clinical and Laboratory Standards Institute, Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Filamentous Fungi,2009,M38-A2,vol.28,No16.

[13]  CLSI.Clinical and Laboratory Standards Institute,principles and procedures for blood cultures;  approved  guideline,2009, M47-A2,vol.28,No16.

[14]  EUCAST.The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs. Version 6.1,2013.http://www.eucast.org

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