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MIT

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1 概述

MIT(巨噬細胞移動抑制試驗)是體外測定機體特異性細胞免疫反應的一種方法。巨噬細胞移動抑制試驗的原理是人體內致敏淋巴細胞受相應的抗原作用后,可釋放出一種淋巴因子抑制巨噬細胞的正常移動,借助于指示系統的移動情況來了解T淋巴細胞功能

2 MIT的別名

巨噬細胞移動抑制試驗

3 檢查名稱

MIT

4 分類

免疫學檢查 > 細胞免疫測定

5 化驗取材

血液

6 MIT的原理

移動抑制試驗(migration inhibition test)是指致敏淋巴細胞當再次接觸相應抗原時,可產生移動抑制因子(MIF),后者能夠抑制巨噬細胞的移動。參與此試驗的有三種成分:①被檢測的淋巴細胞。②特異性抗原。③指示細胞,如豚鼠腹腔巨噬細胞,人外周血白細胞等。按選用的指示細胞不同本試驗又分為MIT和白細胞移動抑制試驗

7 試劑

(1)聚蔗糖-泛影葡胺分層液。

(2)Hank液。

(3)PPDSK-SD。

8 操作方法

(1)分離淋巴細胞:取人肝素凝血10ml,用聚蔗糖-泛影葡胺分層液用密度梯度離心法分離淋巴細胞,用Hank液配成5×106/ml細胞懸液,再用2.5g/L伊紅溶液觀察細胞活率。要求細胞活率>95%。所得白細胞中如果含有紅細胞可用紅細胞溶解液或低滲處理加以去除,其中的B細胞可用過尼龍柱的方法除去。

(2)MIF的提取:直接法不需提取MIF。使用間接法時首先應將相應抗原與待測淋巴細胞懸液共同溫育,使其產生MIF,然后再提取配養液中的MIF加以濃縮,具體方法如下:

①將分離的淋巴細胞用不含小牛血清和雙抗的Hank液配成3×106/ml細胞懸液。

②在待測細胞懸液中加入相應抗原,其劑量隨各種抗原性質而定。一般PPD的劑量為100μg/ml溶液,SK-SD50μg/ml。大部分蛋白性抗原用100μg/ml濃度,腫瘤細胞或其提取物的用量在1mg/ml左右。

③將上述混合液置37℃ 5%CO2條件下孵育3天。每天將培養管(800r/min)離心10min,吸去上清后補加無血清培養液至原溶液量,將3天所得上清液混合后置4℃保存

④將混合上清液先經0.15mol/L NaCl 4℃透析過夜,再用蒸餾水透析,換液3次,共計36h。最后冷凍干燥,保存于-20℃,臨用時加蒸餾水恢復至原液量的1/5體積,調節pH至7.4。

(3)收集巨噬細胞:可從豚鼠、小白鼠、大鼠和兔等的淋巴結、肺、肝、脾、外周血、腹腔液中分離巨噬細胞。

①在試驗開始前12h先用心臟抽血或雙側頸動脈放血處死豚鼠,以免腹腔液中混有紅細胞影響結果觀察。豚鼠去毛用碘酒和酒精消毒皮膚后,在無菌條件下收集腹腔滲出細胞。

②將收集到的腹腔液離心(1500~2000r/min)15min,去上清后洗滌細胞3次,計數后配成約7×106/ml的細胞懸液備用。

(4)移動抑制試驗

①細胞懸液的制備:在直接法時,將已制備好的巨噬細胞懸液和待測淋巴細胞懸液以4∶1比例混合;間接法時只用巨噬細胞懸液。

②用毛細管灌注細胞 取內徑為0.8~1.0mm,長約70mm毛細管將其一端用火焰燒融法封閉,然后用1ml注射器和5號針頭將充分混勻的細胞液灌注到毛細管內,勿使其發生氣泡。

③將注滿細胞液的毛細管置于底部填有少許棉絮的離心管內,水平位離心500r/min,5min,使巨噬細胞和白細胞沉入毛細管底部(約2~5mm高),要求各管壓積高度基本一致。用鋸刀在細胞層和液體層交界面鋸斷毛細管,切面要求平整。用小鑷子將有壓積細胞的毛細管黏在凹孔玻璃板的小孔底部(小孔內徑為17mm,深度為5mm),每孔可放2只毛細管。

④直接法時小孔中加入含有抗原的培養液。間接法時加入經濃縮的淋巴細胞培養上清。勿使產生氣泡。直接法的對照小室中只加培養液,不加抗原。間接法則用未加抗原培養的淋巴細胞上清液做對照。

⑤將玻璃管培養于37℃ 5% CO2條件下24h,然后用低倍顯微鏡和顯微掃描儀測量毛細管外細胞游走面積,試驗結果用移動指數(MI)表示。

一般每組試驗作4支毛細管,求出平均移動面積進行比較,同一組中每只毛細管的移動面積相差應在10%~20%之內,否則可能是技術上的誤差

9 正常值

100%左右。

10 化驗結果臨床意義

(1)降低:機體對抗原有特異性作用。

(2)升高:抗原對巨噬細胞有刺激作用或機體有另一種特異性免疫反應存在。

11 附注

(1)為防止污染影響結果,所有器材均要求無菌,操作過程要求在無菌條件下進行。

(2)毛細管內徑要求一致。

(3)在毛細管中灌注細胞時,細胞液要充分混勻,以免因各管濃度差異影響結果。

相關文獻

開放分類:化驗及醫學檢查免疫學檢查細胞免疫測定
詞條MIT
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參與討論
  • 評論總管
    2020/11/26 23:43:18 | #0
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本頁最后修訂于 2013年2月27日 星期三 23:28:36 (GMT+08:00)
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