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GB/T 33419—2016 環氧乙烷滅菌生物指示物檢驗方法

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1 拼音

GB/T 33419—2016 huán yǎng yǐ wán miè jūn shēng wù zhǐ shì wù jiǎn yàn fāng fǎ

2 英文參考

Test method of biological indicator for ethylene oxide sterilization processes

3 基本信息

ICS 11.080

C 50

中華人民共和國國家標準 GB/T 33419—2016《環氧乙烷滅菌生物指示物檢驗方法》(Test method of biological indicator for ethylene oxide sterilization processes)由中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局、中國國家標準化管理委員會于2016年12月30日發布,自2017年07月01日起實施。

4 前言

本標準按照GB/T 1.1—2009給出的規則起草。

本標準由中華人民共和國衛生和計劃生育委員會提出并歸口。

本標準起草單位:江蘇省疾病預防控制中心、中國疾病預防控制中心環境與健康相關產品安全所、國家衛生計生委衛生和計劃生育監督中心、徐州市疾病預防控制中心。

標準起草人:徐燕、孫俊、吳曉松、陳越英、張流波、段亞波、史紹毅、王洪敏、黃靖雄、談智、張劍、王玲、孫巍、張偉、褚宏亮、常桂秋。

5 標準正文

環氧乙烷滅菌生物指示物檢驗方法

5.1 1 范圍

本標準規定了環氧乙烷滅菌生物指示物的術語和定義、技術要求和檢驗方法。

本標準適用于對環氧乙烷滅菌生物指示物的檢驗。

5.2 2 規范性引用文件

下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。

GB 18281.1 醫療保健產品滅菌 生物指示物 第1部分:通則

GB 18281.2 醫療保健產品滅菌 生物指示物 第2部分:環氧乙烷滅菌用生物指示物

GB/T 24628 醫療保健產品滅菌 生物與化學指示物 測試設備

消毒技術規范(2002年版) 衛生部

5.3 3 術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

生物指示物  biological indicator;BI

對指定條件下的特定滅菌程序具有一定抗力,并裝在內層包裝中可供使用的染菌載體。包含菌片和自含式生物指示物

3.2

載體  carrier

試驗微生物的支持物。

3.3

指示微生物  test organism

用于制備染菌載體的微生物。

3.4

活菌計數  viable test organism count

在規定的培養條件下,測定細菌懸液、染菌載體等樣本中含有的活菌數量。通過計算長成的單個菌落數,而得到單位體積菌懸液中或染菌載體上的存活試驗菌菌數。

3.5

D值  D value

設定的條件下,殺滅微生物數量達90%所需的時間。

注:單位為分(min)。

3.6

存活曲線  survlvor curve

在設定的條件下,微生物的存活情況與對滅菌介質暴露變化的關系曲線。

3.7

菌落形成單位  colony-forming unit;CFU

在活菌培養計數時,由單個菌體或聚集成團的多個菌體在固體培養基生長繁殖所形成的集落,以其表達活菌的數量。

3.8

存活-殺滅區間  survival-kill window

在規定的條件下滅菌處理時,生物指示物從全部長菌(存活暴露)過渡到全部不長菌(殺滅暴露)的暴露程序

3.9

自含式生物指示物  self-contained biological indicator

內層包裝中含有細菌復蘇生長所需培養基的牛物指示物。

3.10

存活時間  survival  time;ST

用于生物指示物抗力鑒定時,受試指示物樣本經殺菌因子作用后全部樣本有菌生長的最長作用時間。

3.11

殺滅時間  killing time; KT

用于生物指示物抗力鑒定時,受試指示物樣本經殺菌因子作用后全部樣本無菌生長的最短作用時間。

5.4 4 技術要求

5.4.1 4.1 指示微生物

5.4.1.1 4.1.1 菌種

環氧乙烷滅菌指示微生物應采用枯草桿菌黑色變種(Bacillus atrophaeus ATCC 9372,NCTC 10073,NCIMB 8058, DSM 2277,NRRL B-4418,CIP 77.18)芽胞

5.4.1.2 4.1.2 菌量

回收菌量大于等于1.0×106CFU/片,回收菌量同時應在制造商標明菌量的-50%~+300%范圍內。

5.4.1.3 4.1.3 抗力

當暴露于環氧乙烷濃度600 mg/L±30 mg/L,溫度54℃±1℃,相對濕度60%±10%時,D值大于等于2.5 min,測試的D值應在制造商規定的D值±20%范圍內。

5.4.2 4.2 載體

符合GB 18281.1和GB 18281.2的要求;同時,暴露于溫度大于等于55℃,環氧乙烷濃度大于等于800 mg/L,相對濕度大于等于70%、暴露時間大于等于6h等條件下滅菌過程中不會變形、熔化、腐蝕和其他損壞。

5.4.3 4.3 培養基

4.3.1 培養基和培養條件應能穩定地生產出符合4.1和GB 18281.1和GB 18281.2性能要求的試驗菌懸液。培養基應不影響試驗菌的穩定性,同時要與染菌載體和生物指示物制造工藝和材料相兼容。

4.3.2 恢復培養基:

a)  使10 CFU~100 CFU的微生物恢復生長;

b)使損傷的微生物生長;

c)  經過環氧乙烷滅菌處理后應確保可以抵消任何可能影響指示微生物活性的化合物,并在有效    期內性能和顏色不發生改變。

4.3.3 生物指示物的設計,應有利于初始微生物數量在儲存、運輸和裝卸過程中的基本穩定并防止外界微生物對菌片的污染

5.4.4 4.4 穩定性

生物指示物存放至標簽和說明書規定的條件及有效期限后所有技術參數應符合4.1、4.2、4.3。4.5 生物指示物抗力測定儀要求

生物指示物抗力測定儀應符合GB/T 24628的要求,其余要求見附錄A。

5.5 5 檢驗方法

5.5.1 5.1 活菌計數

5.1.1 通過菌落形成單位檢測方法統計菌片或自含式生物指示物上的試驗活菌。這種方法常用于預期回收菌量在50 CFU以上的情況。

5.1.2 本方法適用于初始活菌數(未處理的樣品)的檢測以及利用存活曲線(處理過的樣品)檢測D值。

5.1.3 測定回收菌量時,最小檢測數量應每批量/批次至少使用4個測試樣品,檢測方法見附錄B。

5.1.4 相關使用材料及配置方法。見《消毒技術規范》2002年版。

5.5.2 5.2 抗力試驗

5.2.1 測試抗力時應使用生物指示物抗力測試儀,要求見附錄A。

5.2.2 D值測定應至少使用以下兩種方法:

a)存活曲線法測定D值(見附錄C);

b)  部分陰性分析法測定D值(見附錄D);

c)  驗證法測試D值將a)或b)測試出的D值和5.1的菌量進行計算,計算出ST值和KT值,進行試驗驗證(見附錄E)。

5.5.3 5.3 恢復培養基對少量菌恢復能力的測試

每個樣本的恢復培養基中,接種10 CFU~100 CFU的枯草桿菌黑色變種芽胞,同時設置陰性對照和陽性對照培養至規定時間后觀察變色情況,如果恢復培養基有菌生長,并且陰性對照無菌生長和陽性對照有菌生長,判斷恢復培養基合格。

5.5.4 5.4 材料對滅菌過程兼容性測試

按GB 18281.1進行。

5.5.5 5.5 穩定性試驗

取包裝完好的同批次生物指示物放置于制造商建議的保存條件下,存放至標簽和說明書規定的有效期限,取出再次進行評價,生物指示物應滿足4.1、4.2、4.3。

6 附錄

6.1 附錄A(規范性附錄)抗力測定儀要求及抗力試驗

6.1.1 A.1 抗力測定儀要求

6.1.1.1 A.1.1 參數要求

時間常數精確度±1s,分辨率1s;溫度范圍25℃~80℃,精確度±0.5℃,分辨率0.1℃,響應時間小于等于500 ms;真空度范圍0 kPa~100 kPa,精確度±1.0 kPa,分辨率0.1 kPa,響應時間小于等于30 ms;壓力范圍100 kPa~200 kPa,精確度±3.5 kPa,分辨率0.1 kPa,響應時間小于等于30 ms;相對濕度范圍20%~900/,精確度±5%,分辨率1%,響應時間15000 ms;環氧乙烷濃度范圍25 mg/L~1200 mg/L,精確度為±設定濃度的5%。

6.1.1.2 A.1.2 記錄范圍

抗力測定儀應能自動記錄上述參數,不少于10s一個數據點。相對濕度和環氧乙烷濃度可由傳感器直接測量,或者由壓力參數推算。

6.1.1.3 A.1.3  其他要求

抗力測定儀應配備有抽真空裝置,讓反應室的真空度低于10 kPa,以便在通入環氧乙烷之前充分排除室內空氣,并與暴露階段結束時把環氧乙烷全部排出,其中通入環氧乙烷氣體達到規定的氣體濃度,所需時間小于等于60 s,排出環氧乙烷氣體達到真空(10 kPa),所需時問亦小于等于60 s。周期結束時輸入的空氣應經濾器濾過,該濾器應能清除不少于99.9%的0.5μm顆粒。

6.1.2 A.2 抗力試驗

A.2.1 放置樣品于合適的載樣器材上。

A.2.2 預熱抗力測定儀反應室至選定測定條件(30℃或54℃)。

A.2.3 放置已有樣品的載樣器材于反應室內,關閉反應室并開始試驗過程。

A.2.4 按以下順序進行操作:

a)  反應室抽真空,達10 kPa±0.5 kPa(或根據制造商提供的信息);

b)充入足量水蒸氣,使反應室內相對濕度達到60%±10%,維持該條件30 min±1 min,樣品應在充入水蒸氣之前加溫到露點以上以避免潛在的水汽凝結;

c)  往室內通入環氧乙烷,在60 s內使濃度達到規定濃度600 mg/L±30 mg/L,在零氣體暴露周期不需要通入環氧乙烷;

d)在規定的暴露時間±5s保持測試條件;

e)  在暴露階段結束時反應室抽真空,在1.5 min內達到10 kPa,接著注入經濾過的空氣或惰性氣體(如氮氣),達到外界氣壓;

f)  重復e)步驟4次。

在上述周期結束時,將指示物從抗力儀中迅速移出,并按要求進行處理。

6.2 附錄B(規范性附錄)活菌培養計數方法

B.1  在無菌試管內加入5 mL含有0.5%吐溫-80的0.03 mol/L磷酸緩沖液,加入適量無菌玻璃珠,將待計數染菌載體投入試管,用電動混勻器振蕩直至染菌載體被完全打碎,制成菌懸液。

B.2 將無菌試管按需要數量分組排列于試管架上,每管加入4.5 mL含有0.5%吐溫-80的0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液。各組由左向右,逐管標上10-1、10-2、10-3……。

B.3 將菌懸液樣本用電動混勻器混合20 s,或在手掌上用力振打80次,隨即吸取0.5 mL加至10-1管內。

B.4 將10-1管依前法用電動混勻器混合20 s,或在手掌上用力振打80次,混勻,再吸取出0.5 mL加入10-2管內。如此類推,直至最后一管。必要時,還可作某稀釋度的1:1或1:4稀釋。

B.5 選擇適宜稀釋度試管(以預計生長菌落數每平板為15 CFU~300 CFU者為宜),吸取其中混合均勻的懸液1.0 mL加于無菌平皿內。每一稀釋度接種2個平皿,一般需接種2個~3個不同稀釋度。

B.6 將40℃~45℃熔化的培養基,傾注于已加入樣液的平皿中,每平皿15 mL~20 mL。

B.7 將平皿蓋好,即刻輕輕搖動混勻,平放。待瓊脂凝固后,翻轉平皿使底向上,置36℃±1℃恒溫培養箱內培養。

B.8 培養至72 h計數菌落數。一般以肉眼觀察,必要時用放大鏡檢查。以每平板菌落數在15 CFU~300 CFU的稀釋度為準記錄結果。

B.9 根據稀釋倍數和接種量計算每一染菌載體上的平均菌落數。

6.3 附錄C(規范性附錄)存活曲線方法測定D值

6.3.1 C.1 總則

本方法是建立在通過直接計數菌落形成單位(CFU)檢測存活試驗菌的數量上,利用活菌計數法檢測存活被測微生物的數量。這種方法可行的最低限約為5×101CFU,見附錄B。

6.3.2 C.2 步驟

C.2.1  測試樣本應暴露于規定的暴露條件。

C.2.2 應至少有5次暴露,而且應包括以下幾方面:

a)  有1次暴露中樣本未經環氧乙烷處理(0暴露時間)。

注:環氧乙烷可不存在或由惰性氣體或介質替代。

b)  至少有1次暴露使活菌數降低到最初接種量的0.01%(減少4 lg)。

c)  至少有3次暴露介于a)和b)情況之間。

C.2.3  每次測定中每次暴露所用的試驗樣本應不少于4個,每次暴露應采用相同的數量試驗樣本。

C.2.4 每次暴露2h內,應對測試樣本進行處理,讓試驗菌從載體上脫落。見附錄B。

C.2.5 用所得的全部存活菌數的常用對數值,對時間(min)作圖,用最小二乘法進行回歸分析,確定最佳線性曲線。回歸分析時不應包括原先菌落數0.5 lg范圍內的存活數據點。計算所得直線斜率的負倒數值,即等于以分鐘表示的指定暴露條件下的D值,同時所得線性曲線相關系數應不小于0.8。

6.4 附錄D(規范性附錄)部分陰性分析法測定D值

6.4.1 D.1 總則

本方法是通過直接觀察指示微生物在液體培養基中的生長情況,來間接確定試驗菌的存活情況。

6.4.2 D.2 檢測方法

6.4.2.1 D.2.1 Holcomb-spearman-karher法(HSKP)

D.2.1.1  試驗次數與樣本數量要求

至少應進行5組試驗,至少包括1組所有樣本出現生長情況的試驗、2組部分樣本出現生長情況的試驗、2組經過連續暴露后沒有觀察到出現生長情況的試驗。每組試驗最少使用20個樣本。

D.2.1.2 樣本培養要求

樣本經過暴露后應按照制造商指定的方法培養。根據試驗菌的特點,液體培養基的渾濁度、培養基表面的生長情況或試管底部沉淀物將表明試驗菌的生長情況。如果生長培養基屬于生物指示物的一部分,如自含式生物指示物,則應按照制造商提供的使用說明判斷試驗菌是否出現生長情況(通過觀察 pH值顏色變化,從而顯示自含式生物指示物中試驗菌的生長情況)。

D.2.1.3 利用HSKP計算

D.2.1.3.1  此計算方法是建立在應至少有5組暴露試驗,而且應包含以下條件:

——其中1組樣本應是全部測試菌生長;

——其中2組樣本應有部分樣品生長;

——其中2組樣本應是全部不生長菌(見表D.1)。

表D.1  HSKP計算時所需要的樣本數據

滅菌劑暴露時間(t)

暴露樣本數量(n)

無菌生長的樣本數量(r)

t1(U1

n1

r1a

t2

n2

r2

t3

n3

r3

t4

n4

r4

t5(UK-1

n5

r5

t6(UK

n6

r6(r=n6

表D.1(續)

滅菌劑暴露時間(t)

暴露樣本數量(n)

無菌生長的樣本數量(r)

t7

n7

r7(r=n7

注:t1定義為所有測試樣本均出現生長情況的暴露組中,暴露在滅菌劑下的最長暴露時間;t2~t5是部分陰性區

域的增加時間;t6和t7是所有樣本均沒出現生長情況的連續暴露時間(UK為最終暴露,UK-1為在UK之前

的一次暴露)。

a如果未出現陰性單元,即,未出現陰性試樣(r=0),且所有單元在暴露時間t1前出現生長情況;同時,在暴露

時間t5之后的過程中全部為陰性試樣(r=n7),即未出現生長情況,則測試有效。

D.2.1.3.2 對于暴露在滅菌劑下的暴露時間ti,因子Xi和Yi分別按式(D.1)、式(D.2)計算:

公式

式中:

Xi——用于計算Ui的因子; ti——第i次暴露時間。

公式.PNG

式中:

Yi——用于計算Ui的另一因子;

ri——在暴露時間ti時出現未生長試樣的數量;

ni——在暴露時間ti下暴露的數量。

在t1時間下,所有樣本表現出生長,所以

公式.PNG

從以上Xi和Yi的計算值中,在第i次暴露時間ti的Ui值可以按式(D.3)計算:

公式.PNG

式中:

Ui——第i次暴露時間下時間與未存活樣本的關系值;

Yi——用于計算Ui的另一因子;

Xi——用于計算Ui的因子。

D.2.1.3.3 任何試樣的平均無菌時間UHSK,可以通過對每一次暴露時間ti,i=1…k的Ui值的求和來計算[見式(D.4)]:

公式.PNG

UHSK——平均無菌時間;

Ui——每次暴露時間下時間與未存活樣本的關系值。

D.2.1.3.4 D值用式(D.5)計算:

公式.PNG

式中:

D——D值;

UHSK——平均無菌時間;

N0——每批生物指示物的回收菌量的平均數,用活菌培養計數方法計算(見附錄B)。

注:lg(Euler常量)=lg(0.5772)=-0.2507。

D.2.1.3.5 當暴露時間間隔d是一個常量,在每一個暴露時間下,測試樣品數量n也是一樣的,平均無菌時間的UHSK可以用式(D.6)計算:

公式.PNG

D.2.2  Limited Holcomb-spearman-karber法(LHSKP)

D.2.2.1  LHSKP計算方法的建立條件與HSKP相同,見D.2.1.3.1。

D.2.2.2 UHSK計算公式見式(D.6)。

D.2.2.3 D值計算公式見式(D.5)。

D.2.2.4 LHSKP法需要暴露時間間隔為恒定,并且每次試驗樣本的數量應相同。

6.5 附錄E(規范性附錄)驗證法測定D值

E.1 應分別使用不少于50個相同的樣本,通過存活時間和殺滅時間證實D值。

E.2 樣本暴露后應按照制造商給出的方法進行培養。

E.3 存活時間(ST)和殺滅時間(KT)用式(E.1)、式(E.2)計算:

公式.PNG

式中:

N0——每批生物指示物的回收菌量的平均數。

E.4 暴露時間設定為ST值時,若全部有菌生長,則符合要求,若有樣本無菌生長,則不符合要求;暴露時間設定為KT值時,若全部無菌生長,則符合要求,若有樣本有菌生長,則不符合要求。

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    2017/12/11 22:58:20 | #0
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