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2010年版藥典三部附錄Ⅳ

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1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn sān bù fù lù Ⅳ

中華人民共和國藥典》(2010年版)三部附錄Ⅳ 電泳法

電泳法是指帶電荷的供試品(蛋白質核苷酸等)在惰性支持介質(如紙、醋酸纖維素瓊脂凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等)中,在電場作用下,帶電粒子按各自的速度向極性相反的電極方向進行泳動,使組分分離成狹窄的區帶,用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜或計算其含量的方法。除另有規定外,各電泳法照下述方法操作。

2 附錄Ⅳ A 醋酸纖維素薄膜電泳法

2.1 試劑

(1)巴比妥緩沖液(pH8.6)  稱取巴比妥2.76g、巴比妥鈉15.45g,加水溶解使成1000ml。

(2)氨基黑染色液  稱取氨基黑10B 0.5g,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

(3)漂洗液  量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混勻。

(4)透明液  量取冰醋酸25ml、無水乙醇75ml,混勻。

2.2 測定法

取醋酸纖維素薄膜,裁成2cm×8cm膜條,將無光澤面向下,浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夾于濾紙中,輕輕吸去多余的緩沖液后,將膜條無光澤面向上,置含巴比妥緩沖液(pH8.6)的電泳槽架上,通過濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。于膜條上距負極端2cm處,條狀滴加蛋白質含量約5%的供試品溶液2~3μl,在0.4~0.6mA/cm[總電流量=電流量(mA/cm)×每條膜的寬度(cm)×膜條數]電流條件下電泳;同時取新鮮人血清作對照,電泳時間以白蛋白丙種球蛋白之阿的電泳展開距離約2cm為宜。電泳完畢,將膜條取下浸于氨基黑或麗春紅染色液中,2~3分鐘后,用漂洗液浸洗數次,直至脫去底色為止。將洗凈并完全干燥的膜條浸于透明液中,待全部浸透后,取出平鋪于潔凈的玻板上,干燥后即成透明薄膜,可供測定純度和作標本長期保存。將干燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀采用反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在記錄器上自動繪出各蛋白質組分曲線圖,以人血清作對照,按峰面積計算各蛋白質組分的含量(%)。

2.3 【附注】

采用全自動電泳儀操作時,參考儀器使用說明書進行。

3 附錄Ⅳ B 瓊脂糖凝膠電泳法

3.1 試劑

(1)巴比妥緩沖液(pH8.6)  稱取巴比妥4.14g、巴比妥鈉23.18g,加水適量,加熱使之溶解,放冷至室溫,再加疊氮鈉0.15g,溶解后,加水稀釋至1500ml。

(2)1.5%瓊脂糖溶液  稱取瓊脂糖1.5g,加水50ml

和巴比妥緩沖液(pH8.6) 50ml,加熱使完全溶脹。

(3)0.5%氨基黑溶液  稱取氨基黑10B 0.5g,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

(4)脫色液  量取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混勻。

(5)溴酚藍指示液  稱取溴酚藍50mg,加水使之溶解,并稀釋至100ml。

3.2 對照品

正常人血清或其他適宜的對照品。

3.3 供試品溶液的制備

生理氯化鈉溶液將供試品稀釋成蛋白質濃度為1%~2%的溶液。

3.4 測定法

趁熱將1.5%瓊脂糖溶液傾倒于大小適宜的水平玻板上,其厚度約3mm,靜置,待凝膠凝固成無氣

泡的均勻薄層后,于瓊脂糖凝膠板負極端的1/3處打孔,孔徑2~3mm。置含有巴比妥緩沖液(pH8.6)的電泳槽架上,測定孔加適量供試品溶液和1滴溴酚藍指示液,對照孔加適量對照品及1滴溴酚藍指示液。用3層濾紙搭橋與巴比妥緩沖液(pH8.6)接觸,100V恒壓條件下電泳2小時(指示劑遷移到前沿)。電泳結束后,用0.5%氨基黑溶液染色,再用脫色液脫色至背景無色。

4 附錄Ⅳ C SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

大多數蛋白質與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結合成復合物,使蛋白質分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白質分子的凈電荷,消除了不同蛋白質分子的電荷效應,使蛋白質按分子大小分離。

4.1 儀器

恒壓或恒流電源,垂直板或圓盤電泳槽和制膠模具。

4.2 試劑

(1)水(電阻率不低于18.2MΩ·cm)。

(2)A液  1.5molL三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液。稱取三羥甲基氨基甲烷18.15g,加適量水溶解,用鹽酸調pH值至8.8.加水稀釋至100ml。

(3)B液  30%藹烯酰胺-0.8% N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺溶液(避光保存)。

(4)C液  1%十二烷基硫酸鈉溶液。

(5)D液  10% N,N,N',N'-四甲基乙二胺溶液。(6)E液  10%過硫酸銨溶液,臨用前配制。

(7)F液  0.5mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液。稱取三羥甲基氨基甲烷6.05g加適量水溶解,用鹽酸調pH值至6.8,加水稀釋至100ml。

(8)電極緩沖液  稱取三羥甲基氨基甲烷3g、甘氨酸14.4g、十二烷基硫酸鈉1g,加適量水溶解,用鹽酸調pH值至8.3,加水稀釋至1000ml。

(9)供試品緩沖液  稱取三羥甲基氨基甲烷0.303g、溴酚藍2mg、十二烷基硫酸鈉0.8g,量取鹽酸0.189ml、甘油4ml,加水溶解并稀釋至10ml,此溶液用于非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,如用于還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,則再加β-巰基乙醇2ml。

(10)分子量標準  供試品的分子量應包括在使用的分子量標準范圍之內。

(11)固定液  量取甲醇250ml、冰醋酸60ml,加水稀釋至500ml。

(12)漂洗液  量取乙醇100ml、冰醋酸50ml,加水稀釋至1000ml。

(13)輔染液  稱取重鉻酸鉀10g,量取硝酸2ml加適量水溶解并稀釋至200ml。用前40倍稀釋。

(14)銀染液  稱取硝酸銀2.04g.加水溶解并稀釋至1000ml。

(15)顯色液  稱取碳酸鈉30g,加適量水溶解,加甲醛0.5ml并稀釋至1000ml。

(16)終止液  量取冰醋酸10ml,加水稀釋至1000ml。(17)考馬斯亮藍染色液  稱取考馬斯亮藍R250 1g,加入甲醇200ml、冰醋酸50ml、水250ml,混勻。

(18)考馬斯亮藍脫色液  量取甲醇400ml、冰醋酸100ml與水500ml,混勻。

4.3 供試品溶液的制備

將供試品與供試品緩沖液按3:1的比例混勻,100℃水浴加熱3~5分鐘。

4.4 測定法

(1)制備分離膠溶液  按下表制成分離膠溶液,灌入模具內至一定高度,加水封頂,室溫下聚合(室溫不同,聚合時間不同)。

凝膠種類

分離膠溶液

濃縮膠

溶液

凝膠濃度

5%

7. 5%

10%

12.5%

15%

17.5%

4.5%

A液

4

4

4

4

4

4

B液

2.7

4

5.4

6.7

8

9.4

1.35

C液

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

1.6

0.9

試液/ml

D液

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.07

E液

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.07

F液

2.25

H2O

7.3

6

4.88

3.3

2.28

0.88

4.33

(2)制各濃縮膠溶液  待分離膠溶液聚合后,用濾紙吸去上面的水層,再灌入濃縮膠溶液(配方見上表),插入樣品梳,注意避免氣泡出現。

(3)加樣  待濃縮膠溶液聚合后小心拔出樣品梳,將電極緩沖液注滿電泳槽前后槽,在供試品孔中加入供試品溶液5μg(銀染法)或10μg以上(考馬斯亮藍染色法)。

(4)電泳  接通電源、冷凝水,以恒流10mA條件下開始電泳,至供試品溶液進入分離膠后將電流調至20mA,直至電泳結束。

(5)固定與染色

①銀染法  除另有規定外,銀染法一般不用于定量試驗;做定性試驗時,上樣量可以適當增加。將電泳后的凝膠浸入固定液中過夜,取出,用漂洗液漂洗3次(溫度應不低于25℃),每次10分鐘;漂洗后的凝膠浸于輔染液中7~10分鐘后取出,用水浸洗3次,每次2分鐘;將浸洗后的凝膠浸于銀染液中,置較強日光或類似光源下照射30分鐘,再于室內光線下放置20分鐘;將凝膠自銀染液中取出,用水浸洗2次,每次1分鐘;然后將凝膠浸于顯色液中,每隔2分鐘換液1次,直至蛋白質條帶顯色完全;將凝膠浸于終止液中10分鐘后,取出凝膠保存于水中。

②考馬斯亮藍法  將電泳后的凝膠浸入染色液中過夜取出,浸入脫色液中,直至凝膠底色幾乎無色,取出凝膠保存在水中。

4.5 結果計算

非還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠經掃描進行純度分析;還原型SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的凝膠中分子量標準,經掃描獲得分子量標準曲線,計算供試品的分子量。

5 附錄Ⅳ D 等電聚焦電泳法

兩性電解質在電泳場中形成一個pH梯度,由于蛋白質為兩性化合物,其所帶的電荷與介質的pH值有關,帶電的蛋白質在電泳中向極性相反的方向遷移,當到達其等電點(此處的pH值使相應的蛋白質不再帶電)時,電流達到最小,不再移動。本法用于檢測蛋白質類供試品的等電點。

5.1 第一法 等電聚焦垂直板電泳

5.1.1 試劑

(1)水(電阻率不低于18.2MΩ·cm)。

(2)A液  稱取丙烯酰胺29.1g、亞甲基雙丙烯酰胺0.9g,加適量水溶解,并稀釋至100ml,雙層濾紙濾過,避光保存。

(3)B液  10%過硫酸銨溶液,臨用前配制。

(4)供試品緩沖液(4倍濃度)  量取甘油8ml、40%兩性電解質(pH3~10)溶液4ml,加水至20ml。加0.1%甲基紅溶液20μl。

(5)固定液  稱取三氯乙酸34.5g、磺基水楊酸10.4g,加水溶解并稀釋至300ml。

(6)脫色液(平衡液)  量取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml,加水稀釋至2000ml。

(7)染色液  稱取考馬斯亮藍G250(或R250)0.35g,加脫色液300ml,在60~70℃水浴中加熱,使溶解。

(8)保存液  量取甘油30ml,加脫色液300ml,混勻。

(9)正極液(0.01mol/L磷酸溶液)  量取磷酸1ml,加水至1800ml。

(10)負極液(0.01mol/L氫氧化鈉溶液)  稱取氫氧化鈉0.4g,加水溶解并稀釋至1000ml。

5.1.2 供試品溶液的制備

供試品對水透析(或用其他方法)脫鹽后,與供試品緩沖液按3:1(體積比)混勻(供試品溶液最終濃度應在每1ml含0.5mg以上,如供試品濃度太低,則需要采用適當方法濃縮)。

5.1.3 測定法

裝好垂直平板電泳槽,壓水,于玻璃板和玻璃紙之間加入60%甘油1ml。取水12ml、甘油2ml、A液4.0ml、兩性電解質(pH3~10)溶液(或其他兩性電解質)1.0ml,混勻,脫氣,再加B液72μl,N,N,N',N'-四甲基乙二胺3μl,混勻后注入槽內聚合1小時。每孔加供試品緩沖液20μl,接通冷卻循環水,于10℃、250V(約10mA)條件下電泳30分鐘。每孔加樣20μl,于10℃、500v(約10mA),上限電壓2000V條件下,電泳約3.5小時,同時做等電點標準。電泳結束后,即將凝膠放入固定液中固定20分鐘以上;取出,放入平衡液中20~30分鐘;再放入染色液中40~60分鐘,然后用脫色液浸洗至背景無色,取出放入保存液中30分鐘;亦可做成干膠保存。以標準品的等電點(pI)對其相應的遷移距離作直線回歸,將供試品的遷移距離代入直線回歸方程,求出供試品的等電點。

5.2 第二法 等電聚焦水平板電泳

5.2.1 試劑

(1)水(電阻率應不低于18MΩ·cm)。

(2)A液  稱取丙烯酰胺29.1g、亞甲基雙丙烯酰胺0.9g,加適量水溶解,并稀釋至100ml,雙層濾紙濾過,避光保存。

(3)B液  10%過硫酸銨溶液,臨用前配制。

(4)固定液  稱取三氯乙酸34.5g、磺基水楊酸10.4g,加水溶解并稀釋至300ml。

(5)脫色液(平衡液)  量取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml.加水稀釋至2000ml。

(6)染色液  稱取考馬斯亮藍G250(或R250)0.35g,加脫色液300ml,在60~70℃水浴中加熱,使溶解。

(7)保存液  量取甘油30ml,加脫色液300ml,混勻。

(8)正極液(0.5mol/L磷酸溶液)  量取磷酸50ml.加水至1800ml。

(9)負極液(0.2mol/L氫氧化鈉溶液)  稱取氫氧化鈉8g,加水溶解并稀釋至1000ml。

5.2.2 供試品溶液的制備

將供試品對水透析(或用其他方法)脫鹽,并使蛋白質含量調節至每1ml含0.5mg以上(如供試品蛋白質濃度太低,則需采用適當方法濃縮)。

5.2.3 測定法

量取A液6.25ml、pH 3~10兩性電解質(或其他兩性電解質)1.5ml、水17.1ml,抽氣5~10分鐘,加B液175μl、N,N,N',N'-四甲基乙二胺20μl,混勻后緩慢地注入水平模具內,室溫下聚合。將已聚合的聚丙烯酰胺凝膠放在冷卻板上,其間涂以液體石蠟煤油并避免產生氣泡。用正極液與負極液分別潤濕正極與負極電極條,然后分別放于陽極與陰極上,將加樣濾紙放在凝膠上。加供試品溶液5~30μl。將電極對準電極條的中心,加蓋,在上限電壓2000V、上限電流50mA、功率為每1cm膠1W、溫度4℃的電泳條件下,開始電泳,電泳2.5小時;同時做等電點標準。電泳30分鐘后去掉加樣濾紙,電泳結束后,即將凝膠放入固定液中固定20分鐘以上;取出放入平衡液20~30分鐘,再放入染色液40~60分鐘,然后用脫色液浸洗至背景無色,取出放入保存液中30分鐘,晾干;亦可做成干膠永久保存。以標準品的等電點(pI)對其相應的遷移距離作直線回歸,將供試品的遷移距離代入直線回歸方程,求出供試品的等電點。

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    2019/10/15 17:57:28 | #0
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