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2010年版藥典二部附錄Ⅻ

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目錄

1 拼音

2010nián bǎn yào diǎn èr bù fù lù Ⅻ

中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄Ⅻ

2 附錄Ⅻ A 升壓素生物測定法

本法系比較垂體后葉標準品(S)與供試品(T)兩者引起大鼠血壓升高的程度,以測定供試品的效價

2.1 標準品溶液的制備

迅速、精密稱取垂體后葉標準品適量,避免吸潮,先加少量0.25%醋酸溶液,仔細研磨,移置硬質大試管中,再精密加入0.25%醋酸溶液使成每1ml中含升壓素1單位的溶液,管口輕放一玻璃塞,浸入沸水浴中,時時振搖,加熱(煮沸)5分鐘取出,迅速冷卻,濾過,濾液分裝于適宜的容器中,4~8℃貯藏經驗保持活性符合要求的條件下,可在3個月內使用。

2.2 標準品稀釋液的制備

試驗當日,精密量取標準品溶液適量,加氯化鈉注射液制成兩種濃度的稀釋液,高低劑量的比值(r)一般不得大于1:0.6,調節劑量使低劑量能引起血壓升高,高劑量應不致使血壓升高達到極限。

2.3 供試品溶液與稀釋液的制備

按供試品的標示量或估計效價(AT),照標準品溶液與稀釋液的制備法制成兩種濃度的稀釋液,其比值(r)應與標準品相等,標準品與供試品高低劑量所致的反應均值應相近。

2.4 測定法

取健康合格,體重300g以上的成年雄性大鼠,用適宜的麻醉劑(如腹腔注射烏拉坦1g/kg)麻醉后,固定于保溫手術臺上,分離氣管,必要時插入氣管插管,以使呼吸暢通。在一側頸靜脈或股靜脈插入靜脈插管,供注射藥液用,按每100g體重注入肝素溶液50~100單位。然后剝離另一側頸動脈,插入與血壓計相連的動脈插管,在血壓計與插管通路中充滿氯化鈉注射液,并于動脈插管中注入適量肝素(約200~400單位)抗凝,全部手術完畢后,將血壓計調節到與動物血壓相當的高度,開啟動脈夾,記錄血壓。緩緩注入適宜的交感神經阻斷藥(如酚妥拉明,按大鼠每100g體重注入0.1mg,隔5~10分鐘用相同劑量再注射一次),待血壓穩定后,即可進行藥液注射,各次藥液的注射速度應基本相同,并于每次注射后立即注入氯化鈉注射液0.3~0.5ml。每次注射應在前一次注射的反應基本穩定以后進行,相鄰兩次注射的間隔時間應相同(約10~15分鐘)。標準品稀釋液和供試品稀釋液備取高低兩個劑量(dS1、dS2、dT1、dT2)為一組,按隨機區組設計的次序輪流注入,每組4個劑量,重復4~6組。測量各劑量所致血壓升高的高度,照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中的量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差

本法的可信限率(FL%)不得大于20%。

3 附錄Ⅻ B 細胞色素C活力測定法

3.1 試劑

(1)磷酸緩沖液(0.2mol/L)  取磷酸氫二鈉71.64g,加水使溶解成1000ml,作為甲液。另取磷酸二氫鈉27.60g,加水使溶解成1000ml,作為乙液。取甲液81ml與乙液19ml,混勻,調節pH值至7.3。

(2)磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L)  取磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L) 500ml,加水稀釋至1000ml,調節pH值至7.3。

(3)磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L)  取磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L)100ml,加水稀釋至1000ml,調節pH值至7.3。

(4)琥珀酸鹽溶液  取琥珀酸與氫氧化鉀各4.72g,加水使溶解成100ml,調節pH值至7.3。

(5)氰化鉀溶液  取氰化鉀0.65g,加水使溶解成100ml后,用稀硫酸調節pH值至7.3。

(6)去細胞色素C的心懸浮液  取新鮮豬(牛)心2只,除去脂肪結締組織,切成條,用絞肉機絞碎,置紗布兜中,用自來水沖洗約2小時(經常攪動,擠出血色素),擠干,用水洗數次,擠干,置磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L)中浸泡約1小時,擠干,重復浸泡1次,用水洗數次,擠干,置組織搗碎機內,加磷酸鹽緩沖液(0.02mol/L)適量恰使豬(牛)心浸沒,搗成勻漿,離心10分鐘(普通離心機),取上層混懸液,加冰塊少量,迅速用稀醋酸調節pH值至約5.5,立即離心15分鐘,取沉淀,加等體積的磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L),用玻璃勻漿器磨勻后,貯存于冰箱中;臨用時取1.0ml,加磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L)稀釋至10ml。

3.2 供試品溶液的制備

取供試品,加水制成每1ml中含細胞色素C約3mg的溶液。

3.3 測定法

取磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L)5ml、琥珀酸鹽溶液1.0ml與供試品溶液0.5ml(如系還原型制劑,應加入0.01mol/L鐵氰化鉀溶液0.05ml),置25ml具塞比色管中,加去細胞色素C的心懸浮液0.5ml與氰化鉀溶液1.0ml,加水稀釋至10ml,搖勻,以同樣的試劑作空白,照紫外-可見分光光度法2010年版藥典二部附錄Ⅳ A),在550nm的波長處附近,間隔0.5nm找出最大吸收波長,并測定吸光度,直至吸光度不再增大為止,作為酶還原吸光度;然后各加連二亞硫酸鈉約5mg,搖勻,放置約10分鐘,在上述同一波長處測定吸光度,直至吸光度不再增大為止,作為化學還原吸光度;按下式計算:

4 附錄Ⅻ C 玻璃酸酶測定法

4.1 試劑

(1)醋酸-醋酸鉀緩沖液  取醋酸鉀14g,冰醋酸20.5ml,再加水稀釋至1000ml。

(2)磷酸鹽緩沖液  取磷酸二氫鈉2.5g、無水磷酸氫二鈉1.0g與氯化鈉8.2g,加水溶解至1000ml。

(3)水解明膠  取明膠50g,加水1000ml,在121℃加熱90分鐘,然后冷凍干燥

(4)水解明膠稀釋液  取磷酸鹽緩沖液與水各250ml,加水解明膠330mg,搖勻,在0~4℃保存。如溶液不發生渾濁,可繼續使用。

(5)血清貯備液  取新鮮牛血清或凍干牛血清(先用水溶解并稀釋至標示量體積)1份,加醋酸-醋酸鉀緩沖液9份稀釋,再以4mol/L鹽酸溶液調節pH值至3.1,放置18~24小時后再用。在0~4℃保存,可應用30日。

(6)血清溶液  血清貯備液中血清總固體(取牛血清適量,置裝有潔凈砂粒并在105℃干燥至恒重的坩堝中,置水浴上蒸干后,再在105℃干燥至恒重)在8%左右者,取1份,用醋酸-醋酸鉀緩沖液3份稀釋;血清總固體在5%左右者,取1份,用醋酸-醋酸鉀緩沖液2份稀釋。臨用時制備。

(7)玻璃酸鉀貯備液  取預先經五氧化二磷減壓干燥48小時的玻璃酸鉀,加水制成每1ml中含0.5mg的溶液。在0℃以下保存,可應用30日。

(8)玻璃酸鉀溶液  取玻璃酸鉀貯備液1份,用磷酸鹽緩沖液1份稀釋。臨用時制備。

4.2 標準品溶液的制備

精密稱取玻璃酸酶標準品適量,加冷的水解明膠稀釋液制成每1ml中含1.5單位的溶液。臨用時制備。

4.3 供試品溶液的制備

按供試品的標示量或估計效價精密稱取供試品適量,加冷的水解明膠稀釋液制成每1ml中含約1.5單位的溶液。臨用時制備。

4.4 標準曲線的制備

大小相同的試管12支,按順序加入標準品溶液0.00ml、0.10ml、0.20ml、0.30ml、0.40ml與0.50ml,各2支;再依次相應加入水解明膠稀釋液0.50ml、0.40ml、0.30ml、0.20ml、0.10ml與0.00ml,每隔30秒鐘順序加入玻璃酸鉀溶液0.50ml,使每一管的總體積為1.00ml,搖勻,置37℃±0.5℃水浴中;每管準確保溫30分鐘后,每間隔30秒鐘順序取出,立即順序加入血清溶液4.0ml,搖勻,在室溫放置30分鐘,搖勻,在640nm的波長處測定吸光度;同時以磷酸鹽緩沖液0.50ml代替玻璃酸鉀溶液,加水解明膠稀釋液0.50ml,搖勻,按上述方法自“置37℃±0.5℃的水浴中”起同法操作,作為空白。以吸光度為縱坐標,標準品溶液的效價(單位)為橫坐標繪制標準曲線。

4.5 測定法

取大小相同的試管6支,依次加供試品溶液0.20ml、0.30ml與0.40ml,各2支;再依次相應加入水解明膠稀釋液0.30ml、0.20ml與0.10ml,照標準曲線的制備項下,自“每隔30秒鐘順序加入玻璃酸鉀溶液0.50ml”起,依法測定,自標準曲線上查得效價(單位)后,分別除以供試品的重量(mg),算出6份供試品的平均數,即為玻璃酸酶的效價(單位)。

5 附錄Ⅻ D 肝素生物測定法

本法系比較肝素標準品(S)與供試品(T)延長新鮮兔血或兔、豬血漿凝結時間的作用,以測定供試品的效價。

5.1 標準品溶液的制備

精密稱取肝素標準品適量,按標示效價加滅菌注射用水溶解使成每1ml中含100單位的溶液,分裝于適宜的容器內,4~8℃貯存,經驗證保持活性符合要求的條件下,可在3個月內使用。

5.2 標準品稀釋液的制備

試驗當日,精密量取標準品溶液,按高、中、低劑量組(dS3、dS2、dS1用氯化鈉注射液配成3種濃度的稀釋液,相鄰兩濃度的比值(r)應相等;調節劑量使低劑量組各管的平均凝結時間較不加肝素對照管組明顯延長,一般以大于1.5倍空白血漿的凝固時間為宜[1]。高劑量組各管的平均凝結時間,用新鮮兔血者,以不超過60分鐘為宜,其稀釋液一般可制成每1ml中含肝素2~5單位,r為1:0.7左右;用血漿復鈣法[1]者,以不超過30分鐘為宜,其稀釋液一般可制成每1ml中含肝素0.5~1.5單位,r為1:0.85左右。用活化部分凝血活酶時間測定法(APTT法)者,一般以不超過90秒為宜,其稀釋液濃度一般可制成每1ml含肝素0.4~1.7單位,r為1:0.85左右,可根據實驗情況調整。[1]

5.3 供試品溶液與稀釋液的制備

按供試品的標示量或估計效價(AT),照標準品溶液與稀釋液的制備法制成高、中、低(dT3、dT2、dT1)3種濃度的稀釋液。相鄰兩濃度之比值(r)應與標準品相等,供試品與標準品各劑量組的凝結時間應相近。

5.4 血漿的制備

迅速收集兔或豬血至預先放有109mmol/L枸櫞酸鈉溶液的容器中,枸櫞酸鈉溶液與血液容積之比為1:9[1],邊收集邊輕輕振搖,混勻,室溫下1500×g離心不少于15分鐘([1]g為重力常數)。立即吸出血漿,并分成若干份分裝于適宜容器內,低溫凍結貯存。臨用時置37℃±0.5℃水浴中融化,用兩層紗布或快速濾紙濾過,使用過程中在4~8℃放置。血漿復鈣法可使用兔或豬血漿;APTT法使用兔血漿。[1]

5.5 測定法

(1)兔全血[1]  取管徑均勻(0.8cm×3.8cm或1.0cm×7.5cm)、清潔干燥的小試管若干支,每管加入一種濃度的標準品或供試品稀釋液0.1ml,每種濃度不得少于3管,各濃度的試管支數相等。取剛抽出的兔血適量,分別注入小試管內,每管0.9ml,立即混勻,避免產生氣泡,并開始計算時間。將小試管置37℃±0.5℃恒溫水浴中,從動物采血時起至小試管放入恒溫水浴的時間不得超過3分鐘,注意觀察并記錄各管的凝結時間。

(2)血漿復鈣法[1]  取上述規格的小試管若干支,分別加入血漿一定量,置37℃±0.5℃恒溫水浴中預熱5~10分鐘后,依次每管加入一種濃度的標準品或供試品稀釋液及1%氯化鈣溶液,每種濃度不得少于3管,各濃度的試管支數相等,血漿、肝素稀釋液和氯化鈣溶液的加入量分別為0.5ml、0.4ml和0.1ml,或0.8ml、0.1ml和0.1ml,加入氯化鈣溶液后,立即混勻,避免產生氣泡,并開始計算時間,注意觀察并記錄各管凝結時間。

(3)APTT法 取血液凝固分析儀樣品杯若干,每管依次加入血漿50μl、一種濃度的標準品或供試品稀釋液50μl、APTT試劑50μl,混勻,應避免產生氣泡。37℃±0.5℃預溫180秒后,每管再加入CaCl2試劑50μl,然后立即用血液凝固分析儀測定含藥血漿的凝結時間,即活化部分凝血活酶時間(APTT)。標準品或供試品稀釋液每個濃度的測定次數不得少于3次,各濃度的測定次數應相同。測定時,血漿、標準品或供試品稀釋液、APTT試劑、CaCl2試劑的加入比例和預溫時間可根據儀器或試劑的說明書適當調整。測定順序以保證標準品和供試品測定的平行性為原則,應盡量保證相同濃度的標準品和供試品稀釋液的測定時間接近。

[1]

將上述方法測得的[1]各管凝結時間換算成對數,照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中的量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差。

測定法(1)的可信限率(FL%)不得大于10%。測定法(2)的可信限率(FL%)不得大于5%。

6 附錄Ⅻ E 絨促性素生物測定法

本法系比較絨促性素標準品(S)與供試品(T)對幼小鼠子宮增重的作用,以測定供試品的效價。

6.1 標準品溶液的制備

試驗當日,按絨促性素標準品的標示效價加0.9%氯化鈉溶液制成每1ml中含10單位的溶液,充分溶解后,再用0.5%羧甲基纖維素鈉溶液按高、中、低劑量組(dS3、dS2、dS1)配成3種濃度的稀釋液,相鄰兩濃度之比值(r)應相等,且不得大于1:0.5。一般高濃度稀釋液可制成每1ml中含0.3~0.8單位。調節劑量使低劑量組子宮較正常子宮明顯增重,高劑量組子宮增重不致達到極限。稀釋液置4~8℃貯存,可供3日使用。

6.2 供試品溶液的制備

按供試品的標示量或估計效價(AT),照標準品溶液的制備法制成高、中、低(dT3、dT2、dT1)3種濃度的稀釋液,相鄰兩濃度之比值(r)應與標準品相等,供試品與標準品各劑量組所致反應平均值應相近。

6.3 測定法

取健康合格,出生17~23日,體重9~13g,同一來源的雌性幼小鼠,一次實驗所用幼小鼠的出生日數相差不得超過3日,體重相差不得超過3g;按體重隨機等分成6組,每組不少于15只。每日于大致相同的時間分別給每鼠皮下注入一種濃度的標準品或供試品稀釋液0.2ml,每日1次,連續注入3次,于最后1次注入24小時后,將動物處死,稱體重,解剖,于陰道和子宮交接處剪斷,摘出子宮,剝離附著的組織,去掉卵巢,壓干子宮內液,直接稱重(天平精密度為0.1mg)并換算成每10g體重的子宮重,照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中的量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差。

本法的可信限率(FL%)不得大于25%。

7 附錄Ⅻ F 縮宮素生物測定法

本法系比較垂體后葉或合成縮官素標準品(S)與供試品(T)引起離體大鼠子宮收縮的作用,以測定供試品的效價。標準品溶液的制備  迅速精密稱取垂體后葉標準品適量,避免吸潮,先加少量0.25%醋酸溶液,仔細研磨,移置硬質大試管中,再精密加0.25%醋酸溶液使成每1ml中含縮宮素1單位的溶液。管口輕放一玻璃塞,浸入沸騰的水中,時時振搖,加熱煮沸5分鐘取出,迅速冷卻,濾過,濾液分裝于適宜的容器內,4~8℃貯存,經驗證保持活性符合要求的條件下,可在3個月內使用。

7.1 標準品稀釋液的制備

試驗當日,精密量取垂體后葉標準品溶液適量或取合成縮宮素標準品,按標示效價加0.9%氯化鈉溶液制成每1ml中含縮宮素1單位的溶液,按高低劑量組(dS2、dS1)加0.9%氯化鈉溶液制成兩種濃度的稀釋液,一般高濃度稀釋液可制成每1ml中含0.01~0.02單位,高低劑量的比值(r)一般不得大于1:0.7。調節劑量使低劑量能引起子宮收縮,記錄儀指針一般在20~50mm;高劑量應不致使子宮收縮達到極限,記錄儀指針一般為50~85mm,且高低劑量所致子宮的收縮應有明顯差別。

7.2 供試品溶液與稀釋液的制備

按供試品的標示量或估計效價(AT),照標準品溶液與其稀釋液的制備法制成供試品高低兩種濃度的稀釋液,其比值(r)應與標準品相等,供試品和標準品高低劑量所致的反應均值應相近。

7.3 子宮肌蓄養液的制備

試驗當日,取氯化鈉9g、氯化鉀0.42g、氯化鈣(按無水物計算)0.06g與葡萄糖0.5g,加水700ml使溶解,另取碳酸氫鈉0.5g,加水約200ml溶解后,緩緩傾注于前一溶液中,隨加隨攪拌,最后加水適量使成1000ml。

7.4 供試用動物

取健康合格的成年雌性大鼠,斷乳后即與雄鼠隔離,出生后不超過3個月,體重160~240g。試驗當日,選擇陰道涂片在動情前期的動物,也可用雌性激素處理使子宮涂片為動情前期或動情期的動物。

7.5 測定法

取選定的大鼠迅速處死,剖腹取出子宮,仔細分離附在子宮肌上的結締組織,注意避免因牽拉使子宮肌受損。在子宮分叉處剪下左右2條,取一條將其下端固定于離體器官恒溫水浴裝置的浴杯底部,上端用線與記錄裝置相連,以描記子宮收縮;浴杯中加入一定量的子宮肌蓄養液(約30~50ml),連續通入適量空氣。蓄養液應調節至32~35℃并保持恒溫(±0.5℃),子宮放入浴杯后,靜置約15分鐘,按次序準確注入等體積的標準品或供試品兩種濃度的稀釋液(0.3~0.8ml),待子宮肌收縮至最高點開始松弛時(約60~90秒鐘),放去蓄養液并用蓄養液洗滌一次,再加入等量蓄養液,靜置;相鄰兩次給藥的間隔時間應相等(約3~5分鐘),每次給藥應在前一次反應恢復穩定以后進行。標準品稀釋液和供試品稀釋液各取高低兩個劑量(dS2、dS1、dT2、dT1)為一組,按隨機區組設計的次序輪流注入每組4個劑量,重復4~6組。測量各劑量所致子宮收縮的高度,照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中的量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差。

本法的可信限率(FL%)不得大于10%。

8 附錄Ⅻ G 胰島素生物測定法

本法系比較胰島素標準品(S)與供試品(T)引起小鼠血糖下降的作用,以測定供試品的效價。

8.1 標準品溶液的制備

精密稱取胰島素標準品適量,按標示效價,加入每100ml中含有苯酚0.2g并用鹽酸調節pH值為2.5的0.9%氯化鈉溶液,使溶解成每1ml中含20單位的溶液,4~8℃貯存,以不超過5天為宣。

8.2 標準品稀釋液的制備

試驗當日,精密量取標準品溶液適量,按高低劑量組(dS2、dS1)加0.9%氯化鈉溶液(pH2.5)制成兩種濃度的稀釋液,高低劑量的比值(r)不得大于1:0.5。高濃度稀釋液一般可制成每1ml中含0.06~0.12單位,調節劑量使低劑量能引起血糖明顯下降,高劑量不致引起血糖過度降低,高低劑量間引起的血糖下降有明顯差別。

8.3 供試品溶液與稀釋液的制備

按供試品的標示量或估計效價(AT),照標準品溶液與其稀釋液的制備法制成高、低兩種濃度的稀釋液,其比值(r)應與標準品相等,供試品與標準品高低劑量所致的反應平均值應相近。

8.4 測定法

取健康合格、同一來源、同一性別、出生日期相近的成年小鼠,體重相差不得超過3g,按體重隨機等分成4組,每組不少于10只,逐只編號,各組小鼠分別自皮下注入一種濃度的標準品或供試品稀釋液,每鼠0.2~0.3ml,但各鼠的注射體積(ml)應相等。注射后40分鐘,按給藥順序分別自眼靜脈叢采血,用適宜的方法,如葡萄糖氧化酶-過氧化酶法測定血糖值。第一次給藥后間隔至少3小時,按雙交叉設計,對每組的各鼠進行第二次給藥,并測定給藥后40分鐘的血糖值。照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中量反應平行線測定雙交叉設計法計算效價及實驗誤差。

本法的可信限率(FL%)不得大于25%。

9 附錄Ⅻ H 精蛋白鋅胰島素注射液延緩作用測定法

本法系比較胰島素標準品(S)與供試品(T)降低家兔血糖的情況,以判定供試品延緩作用是否符合規定

9.1 標準品溶液的制備

精密稱取胰島素標準品適量,加入每100ml中含有苯酚0.2g并用鹽酸調節pH值為2.5的0.9%氯化鈉溶液,使溶解成每1ml所含效價(單位)與供試品相同的溶液。

9.2 供試品溶液

直接注射,不稀釋。

9.3 檢查

取體重2.0~3.0kg的健康家兔若干只,雌兔須無孕,分置籠中,每籠1只。實驗前18~20小時禁食,但仍給予飲水,按體重、性別隨機等分為兩組,一組為胰島素標準品組,另一組為供試品組;兩組間家兔的性別和體重的分配情況應盡可能相同。在實驗過程中,應停止飲水,注意避免驚擾,分別自各兔耳靜脈取血樣(不得多于1.5ml),供測定正常血糖值用。然后分別在各兔相同部位精確皮下注射相同體積的胰島素標準品溶液或供試品溶液,一般劑量為每兔1.2單位。胰島素標準品組于注射后2小時及6小時,供試品組于注射后6小時及9小時,再分別自各兔取血樣,用適宜的血糖測定法精密測定各血樣的血糖值,以每100ml血液中所含葡萄糖的重量(mg)表示。

各次測定所得血糖值均不低于正常血糖值90%的家兔,或實驗中途死亡的家兔,其記錄均作廢,不參加計算;參加計算的家兔,每組不得少于6只,計算每兔在注射后的血糖值相當于該兔在注射前的正常血糖值的比率(%)(簡稱血糖百分數),然后計算每一組內每一時間各兔血糖百分數的平均值。

9.4 結果判斷

用于胰島素標準品組的所有家兔,發生痙攣或實驗中途死亡的動物數,不得超過1/5;胰島素標準品組于注射后2小時的血糖百分數平均值應不高于65%,注射后6小時的血糖百分數平均值應不低于95%,否則均應適當調整劑量,復試。供試品組于注射后6小時或9小時的血糖百分數平均值中較低的一值不得大于75%。

10 附錄Ⅻ J 硫酸魚精蛋白生物測定法

本法系測定硫酸魚精蛋白供試品(T)中和肝素標準品(S)所致延長新鮮兔血或豬、兔血漿凝結時間的程度,以測定供試品效價的方法。

10.1 肝素標準品溶液的制備

精密稱取肝素標準品適量,按標示效價加0.9%氯化鈉溶液溶解使成幾種不同濃度的溶液,相鄰兩種濃度每1ml中所含肝素效價(單位)相差應相等,且不超過5個單位,一般可配成每1ml中含85單位、90單位、95單位、100單位、105單位、110單位、115單位、120單位、125單位等的溶液。

10.2 供試品溶液的制備

供試品如為粉末,精密稱取適量,按干燥品計算,加0.9%氯化鈉溶液溶解使成每1ml中含1mg的溶液。供試品如為注射液,則按標示量加0.9%氯化鈉溶液稀釋至同樣濃度。

10.3 血漿的制備

同肝素生物測定法中血漿制備法制備(2010年版藥典二部附錄Ⅻ D)。

10.4 測定法

取管徑均勻(0.8cm×3.8cm)、清潔干燥的小試管8支,第1管和第8管為空白對照管,加入0.9%氯化鈉溶液0.2ml,第2~7管為供試品管,每管均加入供試品溶液0.1ml,再每管分別加入上述一種濃度的肝素標準品稀釋液0.1ml,立即混勻。取剛抽出的兔血適量,分別加入上述8支試管內,每管0.8ml,立即混勻,避免產生氣泡,并開始計算時間,將小試管置37℃±0.5℃恒溫水浴中,從采動物血時起至小試管放入恒溫水浴的時間不得超過2分鐘;如用血漿,則分別于上述各管中加入0.7ml的血漿,置37℃±0.5℃恒溫水浴中預熱5~10分鐘,每管分別加入1%氯化鈣溶液0.1ml,立即混勻,避免產生氣泡,并開始計算時間。觀察并記錄各管凝結時間。

10.5 結果判斷

兩支對照管的凝結時間相差不得超過1.35倍。在供試品管的凝結時間不超過兩支對照管平均凝結時間150%的各管中,以肝素濃度最高的一管作為終點管。

同樣重復5次,5次試驗測得終點管的肝素濃度,相差不得大于10個單位。5次結果的平均值,即為硫酸魚精蛋白供試品(干燥品)1mg中和肝素的效價(單位)。

11 附錄Ⅻ K 洋地黃生物測定法

本法系比較洋地黃標準品(S)與供試品(T)對鴿的最小致死量(u/kg),以測定供試品的效價。

11.1 標準品溶液的制備

迅速精密稱取洋地黃標準品適量,避免吸潮,置玻璃容器內,按標示效價計算,每1單位精密加入76%乙醇1ml,密塞,連續振搖1小時,靜置片刻,用干燥濾器迅速濾過,防止乙醇揮發,濾液即為每1ml中含1單位的溶液,4~8℃貯存,經驗證保持活性符合要求的條件下,可在1個月內使用。

11.2 標準品稀釋液的制備

試驗當日,精密量取標準品溶液適量,用0.9%氯化鈉溶液稀釋,稀釋液濃度(u/ml)應調節適當(一般可用1→30),使鴿的平均最小致死量為25~34ml。供試品溶液和稀釋液的制備  供試品如為粉末,精密稱取適量,按標示量或估計效價(AT),照標準品溶液及其稀釋液的制備法制備;供試品如為片劑,取20片以上,精密稱重,求出平均片重,迅速研細,再精密稱取不少于20片的粉末,按稱重及標示量(AT)計算,照標準品溶液及其稀釋液制備法制備。供試品稀釋液和標準品稀釋液的鴿平均最小致死量(ml)應相近。

11.3 測定法

取健康合格的鴿,試驗前16~24小時禁食,但仍給予飲水,臨試驗前準確稱重,選取體重在250~400g的鴿(每次試驗所用鴿的體重相差不得超過100g),按體重隨機等分成兩組,每組至少6只,一組為標準品組,一組為供試品組,兩組間鴿的情況應盡可能相近。

將鴿仰縛于適宜的固定板上,在一側翼靜脈處拔除羽毛少許,露出翼靜脈,插入與滴定管(精密度0.02ml)相連的注射針頭,緩緩注入標準品稀釋液或供試品稀釋液,開始時,一次注入0.5ml,然后以每分鐘0.2ml等速連續注入,至鴿中毒死亡立即停止注入。一般死亡前有強烈顫抖、惡心嘔吐排便等現象發生,至瞳孔迅速放大、呼吸停止為終點。記錄注入稀釋液的總量(ml),換算成每1kg體重致死量(ml)中所含效價(u/kg),取其10倍量的對數值作為反應值,照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中的直接測定法計算效價及實驗誤差。

本法的可信限率(FL%)不得大于15%。

12 附錄Ⅻ L 葡萄糖酸銻鈉毒力檢查法

本法系比較葡萄糖酸銻鈉標準品(S)與供試品(T)引致小鼠死亡的數量,以判定供試品毒力是否符合規定。

12.1 標準品溶液的制備

精密稱取葡萄糖酸銻鈉標準品適量,按含銻量計算,加適量溫水,攪拌使溶解,加熱(約70℃,15分鐘),補足水至一定量,于50℃恒溫條件下30分鐘(避免水分蒸發),放冷至室溫。用下述規格的小鼠按每1g體重自尾靜脈注入0.02ml標準品溶液,調節濃度,應能使約半數的小鼠死亡,死亡率在20%至80%之間即為適宜濃度。

12.2 供試品溶液的制備

如為粉末,按標準品溶液的制備方法制備。如為注射液,用水稀釋,于50℃恒溫條件下溫浴30分鐘(避免水分蒸發),放冷至室溫,供試品溶液的濃度,應為標準品溶液濃度的83%。

12.3 檢查法

取健康合格、體重17~25g的小鼠40只或20只,每次試驗各鼠間體重相差不得超過3g,按體重隨機等分為兩組,每組20只或10只,一組為標準品組,一組為供試品組,分別按小鼠體重每1g自尾靜脈注入0.02ml標準品溶液或供試品溶液,每只應在4~5秒鐘內勻速注射完畢。立即觀察15分鐘,記錄小鼠死亡數。

12.4 結果判斷

用40只小鼠檢查時,若供試品組小鼠死亡數較標準品組小鼠死亡數少或兩組小鼠死亡數相同,則判定供試品的毒力符合規定;若供試品組的小鼠死亡數較標準品組小鼠死亡數多,則判定供試品的毒力不符合規定。

用20只小鼠檢查對,若供試品組小鼠死亡數較標準品組小鼠死亡數少2只或2只以上,則判定供試品的毒力符合規定;若供試品組小鼠死亡數較標準品組小鼠死亡數多2只或2只以上,則判定供試品的毒力不符合規定;若兩組小鼠死亡數相同或僅相差1只,須另取小鼠20只重新試驗,將前后兩次試驗結果合并計算,按上述使用40只小鼠的結果判斷方法判斷結果。

13 附錄Ⅻ M 卵泡刺激素生物測定法

本法系比較尿促性素標準品(S)與供試品(T)對幼大鼠卵巢增重的作用,以測定供試品中卵泡刺激素的效價。

13.1 溶劑的制備

試驗當日,稱取牛血清白蛋白適量,加0.9%氯化鈉溶液溶解,制成每1ml中含1mg的溶液,充分溶解后,用1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.2±0.2。

精密稱取已知效價的絨促性素(原料或粉針劑均可),加入上述溶液中溶解,制成每1ml中含20單位的溶液,混勻備用。

13.2 標準品溶液的制備

試驗當日,按尿促性素標準品中卵泡刺激素的標示效價,用上述溶劑,按高、中、低劑量組(dS3、dS2、dS1)配成3種濃度的標準品溶液,相鄰兩濃度之比值(r)應相等,且不得大于1:0.5。一般高濃度的標準品溶液可制成每1ml中含2~5單位。調節劑量使低劑量組卵巢明顯增重,高劑量組卵巢增重不致達到極限。標準品溶液置4~8℃貯存,可供3日使用。

13.3 供試品溶液的制備

按供試品中卵泡刺激素的標示量或估計效價(AT),照標準品溶液的制備法制成高、中、低(dT3、dT2、dT1)3種濃度的供試品溶液,相鄰兩濃度之比值(r)應與標準品相等,供試品與標準品各劑量組所致反應平均值應相近。

13.4 測定法

取健康合格,出生19~23日,體重36~50g,同一來源的雌性幼大鼠,一次試驗所用幼大鼠的出生日期相差不得超過3日,體重相差不得超過10g;按體重隨機等分成6組,每組不少于8只,每日子大致相同的時間分別給每鼠皮下注入一種濃度的標準品溶液或供試品溶液0.5ml,每日一次,連續注入3次,于最后一次注入24小時后,將動物處死,解剖,摘出卵巢,剝離附著的組織,去除輸卵管,用濾紙吸去周圍的液體,直接稱重(天平精密度0.1mg),照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中的量反應測定法計算效價及實驗誤差。

本法的可信限率(FL%)不得大于45%。

14 附錄Ⅻ N 黃體生成素生物測定法

本法系比較尿促性素標準品(S)與供試品(T)對幼大鼠精囊增重的作用,以測定供試品中黃體生成素的效價。

14.1 溶劑的制備

試驗當日,稱取牛血清白蛋白適量,加0.9%氯化鈉溶液溶解,制成每1ml中含1mg的溶液,充分溶解后,用1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH值至7.2±0.2。

14.2 標準品溶液的制備

試驗當日,按尿促性素標準品中黃體生成素的標示效價,用上述溶劑,按高、中、低劑量組(dS3、dS2、dS1)制成3種濃度的標準品溶液,相鄰兩濃度之比值(r)應相等,且不得大于1:0.5。一般高濃度標準品溶液可制成每1ml中含8~10單位。調節劑量使低劑量組精囊明顯增重,高劑量組精囊增重不致達到極限。標準品溶液置4~8℃貯存,可供4日使用。

14.3 供試品溶液的制備

按供試品中黃體生成素的標示量或估計效價(AT),照標準品溶液的制備法制成高、中、低(dT3、dT2、dT1)3種濃度的供試品溶液,相鄰兩濃度之比值(r)應與標準品相等,供試品與標準品各劑量組所致反應平均值應相近。

14.4 測定法

取健康合格,出生19~23日,體重36~50g,同一來源的雄性幼大鼠,一次實驗所用幼大鼠的出生日期相差不得超過3日,體重相差不得超過10g;按體重隨機等分成6組,每組不少于6只。每日于大致相同的時間分別給每鼠皮下注入一種濃度的標準品溶液或供試品溶液0.5ml,每日1次,連續注入4次,于最后1次注入24小時后,將動物處死,解剖,摘出整個前列腺,由前葉和精囊交界處剝離出精囊,去除附著的組織,用濾紙吸去周圍的液體,直接稱重(天平精密度0.1mg),照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中的量反應測定法計算效價及實驗誤差。

本法的可信限率(FL%)不得大于35%。

15 附錄Ⅻ O 降鈣素生物測定法

本法系通過比較降鈣素標準品(S)與供試品(T)對大鼠血鈣降低的程度,以測定供試品的效價。

15.1 溶劑的制備

稱取牛血清白蛋白0.2g,加水20ml,混勻,置56℃水浴中保溫1小時,取出放至室溫,于-10~-20℃下凍存。實驗前取出,于36℃±0.5℃水浴中將其融化。加至含有2g醋酸鈉的水溶液中,加入濃鹽酸約3.5ml,再加水至總量近200ml,用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節pH值至3.5~4.5,最后加水至200ml。

15.2 標準品溶液的制備

試驗當日,按降鈣素標準品的標示效價,用上述溶劑,按高、低劑量組(dS2、dS1)配成,2種濃度的標準品溶液。一般高濃度標準品溶液的濃度控制在50~100mIU/ml。高、低濃度的比值(r)不得大于3:1。

15.3 供試品溶液的制備

按供試品中降鈣素的標示量或估計效價(AT),照標準品溶液的制備法制成高、低(dT2、dT1)2種濃度的供試品溶液,其濃度之比值(r)應與標準品相等,供試品與標準品各劑量組所致反應平均值應相近。

15.4 測定法

取健康合格,體重200~250g,同一性別,同一來源的大鼠。一次實驗所用大鼠體重相差不超過20g,實驗前禁食16小時,自由飲用蒸餾水,按體重隨機等分成4組,分別為標準品高、低劑量組和供試品高、低劑量組,每組不少于5只。將各組動物稱重并編號,分別按體重給各組動物于腹部皮下注射(或尾靜脈注射)相應濃度的標準品或供試品溶液,給藥體積為0.4ml/100g體重。注射后每只準確計時1小時,然后按給藥前后順序分別自眼靜脈叢取血。用適宜的方法,如鄰甲酚絡合劑測定血鈣值。照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差。

本法的可信限率(FL%)不得大于45%。

16 附錄Ⅻ P 生長激素生物測定法

16.1 1.去垂體大鼠體重法

本法系通過比較生長激素標準品(S)與供試品(T)對幼齡去垂體大鼠體重增加的程度,以測定供試品效價的一種方法。

16.1.1 標準品溶液的制備

試驗當日,取標準品,按標示效價用含0.1%牛血清白蛋白的0.9%氯化鈉溶液,制成高、低兩種濃度的標準品溶液。一般高濃度標準品溶液配成每1ml含0.1~0.2IU,低濃度標準品溶液配成每1ml含0.025~0.05IU,高低兩濃度比值(r)一般為1:0.25,標準品溶液分裝成每天劑量并密封于-15℃以下保存,臨用時融化。

16.1.2 供試品溶液的制備

按供試品的標示效價或估計效價(AT),照標準品溶液的制備及保存方法制備和保存。

16.1.3 測定法

取同一來源、品系,出生26~28天,體重60~80g,同一性別,健康的大鼠,試驗前2~3周手術摘除垂體,手術后于清潔級以上動物室飼養使其恢復。

取去垂體手術后2~3周、體重變化小于手術前±10%的大鼠,按體重隨機等分成4組,每組至少8只,每只編號并記錄體重。分別自頸部皮下注射一種濃度的標準品溶液或供試品溶液0.5ml,每日1次,連續6日。于最后1次給藥后24小時,處死大鼠,稱體重,必要時實驗結束后可進行尸檢,切開蝶鞍區,肉眼檢查有無垂體殘留,剔除有垂體殘存的大鼠。每只動物給藥后體重增加的克數作為反應值。供試品與標準品各劑量組所致反應的平均值應相當,低劑量組應較正常動物體重有明顯的增加,高劑量組體重增加不致達極限。照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIv)中的量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差。

本法可信限率(FL%)不得大于50%。

16.2 2.去垂體大鼠脛骨

本法系通過比較生長激素標準品(S)與供試品(T)對去垂體大鼠脛骨骨骺板寬度增加的程度,以測定供試品效價的一種方法。

16.2.1 標準品溶液和供試品溶液的制備

同體重法。

16.2.2 測定法

本法可與去垂體大鼠體重法同步進行。待體重法實驗結束后,取下兩腿脛骨,置10%甲醛溶液保存,從脛骨近心端頂部中間沿矢狀面切開,置10%甲醛溶液中保存,水洗10分鐘后,置丙酮溶液中10分鐘,水洗3分鐘,置2%硝酸銀溶液中染色2分鐘,水洗后置水中強光照射至變棕黑色,于10%硫代硫酸鈉溶液固定30秒鐘,置80%乙醇溶液中供測量用。測量時沿刨面切1mm左右薄片,置顯微鏡下測量脛骨骨骺板寬度,作為反應值。照生物檢定統計法(2010年版藥典二部附錄XIV)中的量反應平行線測定法計算效價及實驗誤差。

本法可信限率(FL%)不得大于50%。

17 參考資料

  1. ^ [1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版:第三增補本[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

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  • 評論總管
    2019/10/14 23:52:28 | #0
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