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2010年版藥典二部附錄Ⅶ

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目錄

1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn èr bù fù lù Ⅶ

中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄Ⅶ

2 附錄Ⅶ A 電位滴定法與永停滴定法

電位滴定法與永停滴定法是容量分析中用以確定終點或選擇核對指示劑變色域方法。選用適當的電極系統可以作氧化還原法、中和法(水溶液或非水溶液)、沉淀法、重氮化法或水分測定法第一法等的終點指示。

電位滴定法選用兩支不同的電極。一支為指示電極,其電極電位隨溶液中被分析成分的離子濃度的變化而變化;另一支為參比電極,其電極電位固定不變。在到達滴定終點時,因被分析成分的離子濃度急劇變化而引起指示電極的電位突減或突增,此轉折點稱為突躍點。

永停滴定法采用兩支相同的鉑電極,當在電極間加一低電壓(例如50mV)時,若電極在溶液中極化,則在未到滴定終點時,僅有很小或無電流通過;但當到達終點時,滴定液有過剩,使電極去極化,溶液中即有電流通過,電流計指針突然偏轉,不再回復。反之,若電極由去極化變為極化,則電流計指針從有偏轉回到零點,也不再變動。

2.1 儀器裝置

電位滴定可用電位滴定儀、酸度計或電位差計,永停滴定可用永停滴定儀或按圖示裝置。

永停滴定裝置

圖 永停滴定裝置

電流計的靈敏度除另有規定外,測定水分時用10-6A/格,重氮化法用10-9A/格。所用電極可按下表選擇。

2.2 滴定法

2.2.1 (1)電位滴定法

將盛有供試品溶液的燒杯置電磁攪拌器上,浸入電極,攪拌,并自滴定管中分次滴加滴定液;開始時可每次加入較多的量,攪拌,記錄電位;至將近終點前,則應每次加入少量,攪拌,記錄電位;至突躍點已過,仍應繼續滴加幾次滴定液,并記錄電位。

方法

電極系統

說明

水溶液氧化還原法

鉑-飽和甘汞

鉑電極用加有少量三氯化鐵硝酸或用鉻酸清潔液浸洗

水溶液中和法

玻璃-飽和甘汞

非水溶液中和法

玻璃-飽和甘汞

飽和甘汞電極套管內裝氯化鉀的飽和無水甲醇溶液。玻璃電極用過后應立即清洗并浸在水中保存

水溶液銀量法

銀-玻璃

銀電極可用稀硝酸迅速浸洗

銀-硝酸鉀鹽橋-飽和甘汞

-C≡CH中氫置換

玻璃-硝酸鉀鹽橋-飽和甘汞

硝酸汞電位滴定法

鉑-汞-硫酸亞汞

鉑電極可用10%(g/ml)硫代硫酸鈉溶液浸泡后用水清洗。

汞-硫酸亞汞電極可用稀硝酸浸

泡后用水清洗

永停滴定法

鉑-鉑

鉑電極用加有少量三氯化鐵的硝酸或用鉻酸清潔液浸洗

滴定終點的確定 終點的確定分為作圖法和計算法兩種。作圖法是以指示電極的電位(E)為縱坐標,以滴定液體積(V)為橫坐標,繪制滴定曲線,以滴定曲線的陡然上升或下降部分的中點或曲線的拐點為滴定終點。根據實驗得到的E值與相應的V值,依次計算一級微商△E/△V(相鄰兩次的電位差與相應滴定液體積差之比)和二級微商△2E/△V2(相鄰△E/△V值間的差與相應滴定液體積差之比)值,將測定值(E,V)和計算值列表。再將計算值△E/△V或△2E/△V2作為縱坐標,以相應的滴定液體積(V)為橫坐標作圖,一級微商△E/△V的極值和二級微商△2E/△V2等于零(曲線過零)時對應的體積即為滴定終點。前者稱為一階導數法,終點時的滴定液體積也可由計算求得,即△E/△V達極值時前、后兩個滴定液體積讀數的平均值;后者稱為二階導數法,終點時的滴定液體積也可采用曲線過零前、后兩點坐標的線性內插法計算,即:

捕獲.JPG

式中V0為終點時的滴定液體積;

a為曲線過零前的二級微商絕對值;

b為曲線過零后的二級微商絕對值;

V為a點對應的滴定液體積;

△V為由a點至b點所滴加的滴定液體積。

由于二階導數計算法最準確,所以最為常用。

采用自動電位滴定儀可方便地獲得滴定數據或滴定曲線。

如系供終點時指示劑色調的選擇或核對,可在滴定前加入指示劑,觀察終點前至終點后的顏色變化,以確定該品種在滴定終點時的指示劑顏色。

2.2.2 (2)永停滴定法

用作重氮化法的終點指示時,調節R1使加于電極上的電壓約為50mV。取供試品適量,精密稱定,置燒杯中,除另有規定外,可加水40ml與鹽酸溶液(1→2)15ml,而后置電磁攪拌器上,攪拌使溶解,再加溴化鉀2g,插入鉑-鉑電極后,將滴定管的尖端插入液面下約2/3處,用亞硝酸鈉滴定液(0.1mol/L或0.05mol/L)迅速滴定,隨滴隨攪拌,至近終點時,將滴定管的尖端提出液面,用少量水淋洗尖端,洗液并入溶液中,繼續緩緩滴定,至電流計指針突然偏轉,并不再回復,即為滴定終點。

用作水分測定法第一法的終點指示時,可調節R1使電流計的初始電流為5~10μA,待滴定到電流突增至50~150μA,并持續數分鐘不退回,即為滴定終點。

3 附錄Ⅶ B 非水溶液滴定法

非水溶液滴定法是在非水溶劑中進行滴定的方法。主要用來測定有機堿及其氫鹵酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽或有機酸鹽,以及有機酸的堿金屬鹽類藥物的含量,也用于測定某些有機弱酸的含量。

3.1 非水溶劑的種類

(1)酸性溶劑 有機弱堿在酸性溶劑中可顯著地增強其相對堿度,最常用的酸性溶劑為冰醋酸

(2)堿性溶劑 有機弱酸在堿性溶劑中可顯著地增強其相對酸度,最常用的堿性溶劑為二甲基甲酰胺。

(3)兩性溶劑 兼有酸、堿兩種性能,最常用的為甲醇。

(4)惰性溶劑 這一類溶劑沒有酸、堿性,如苯、三氯甲烷等。

3.2 第一法

除另有規定外,精密稱取供試品適量[約消耗高氯酸滴定液(0.1mol/L) 8ml],加冰醋酸10~30ml使溶解,加各品種項下規定的指示液1~2滴,用高氯酸滴定液(0.1mol/L)滴定。終點顏色應以電位滴定時的突躍點為準,并將滴定的結果用空白試驗校正。

若滴定供試品與標定高氯酸滴定液時的溫度差別超過10℃,則應重新標定;若未超過10℃,則可根據下式將高氯酸滴定液的濃度加以校正:

捕獲.JPG

式中0.0011為冰醋酸的膨脹系數;

t0為標定高氯酸滴定液時的溫度;

t1為滴定供試品時的溫度;

N0為t0時高氯酸滴定液的濃度;

N1為t1時高氯酸滴定液的濃度。

供試品如為氫鹵酸鹽,應在加入醋酸試液3~5ml后,再進行滴定;供試品如為磷酸鹽,可以直接滴定;硫酸鹽也可直接滴定,但滴定至其成為硫酸氫鹽為止;供試品如為硝酸鹽時,因硝酸可使指示劑褪色,終點極難觀察,遇此情況應以電位滴定法指示終點為宜。

電位滴定時用玻璃電極為指示電極,飽和甘汞電極(玻璃套管內裝氯化鉀的飽和無水甲醇溶液)為參比電極。

3.3 第二法

除另有規定外,精密稱取供試品適量(約消耗堿滴定液(0.1mol/L) 8ml],加各品種項下規定的溶劑使溶解,再加規定的指示液1~2滴,用規定的堿滴定液(0.1mol/L)滴定。終點顏色應以電位滴定時的突躍點為準,并將滴定的結果用空白試驗校正。

在滴定過程中,應注意防止溶劑和堿滴定液吸收大氣中的二氧化碳和水蒸氣,以及滴定液中溶劑的揮發

電位滴定時所用的電極同第一法。

4 附錄Ⅶ C 氧瓶燃燒法

本法系將分子中含有鹵素或硫等元素的有機藥物在充滿氧氣的燃燒瓶中進行燃燒,俟燃燒產物被吸入吸收液后,再采用適宜的分析方法來檢查或測定鹵素或硫等元素的含量。

4.1 儀器裝置

燃燒瓶為500ml、1000ml或2000ml磨口、硬質玻璃錐形瓶,瓶塞應嚴密、空心,底部熔封鉑絲一根(直徑為1mm),鉑絲下端做成網狀或螺旋狀,長度約為瓶身長度的2/3,如圖1。

燃燒瓶

圖1燃燒瓶

4.2 操作法

按各品種項下的規定,精密稱取供試品(如為固體,應研細)適量,除另有規定外,置于無灰濾紙(圖2a)中心,按虛線折疊(圖2b)后,固定于鉑絲下端的網內或螺旋處,使尾部露出。如為液體供試品,可在透明膠紙和濾紙做成的紙袋中稱樣,方法為將透明膠紙剪成規定的大小形狀(圖2c),中部貼一約16mm×6mm的無灰濾紙條,并于其突出部分貼一6mm×35mm的無灰濾紙條(圖2d),將膠紙對折,緊粘住底部及另一邊,并使上口敞開(圖2e);精密稱定重量,用滴管將供試品從上口滴在無灰濾紙條上,立即捏緊粘住上口,精密稱定重量,兩次重量之差即為供試品重,將含有供試品的紙袋固定于鉑絲下端的網內或螺旋處,使尾部露出。另在燃燒瓶內按各品種項下的規定加入吸收液,并將瓶口用水濕潤,小心急速通入氧氣約1分鐘(通氣管應接近液面,使瓶內空氣排盡),立即用表面皿覆蓋瓶口,移置他處;點燃包有供試品的濾紙尾部,迅速放入燃燒瓶中,按緊瓶塞,用水少量封閉瓶口,俟燃燒完畢(應無黑色碎片),充分振搖,使生成的煙霧完全吸入吸收液中,放置15分鐘,用水少量沖洗瓶塞及鉑絲,合并洗液及吸收液。同法另做空白試驗。然后按各品種項下規定的方法進行檢查或測定。

濾紙折疊方法

圖2 濾紙折疊方法

【附注】操作中在燃燒時要有防爆措施。

5 附錄Ⅶ D 氮測定法

5.1 第一法(常量法)

取供試品適量(約相當于含氮量25~30mg),精密稱定,供試品如為固體或半固體,可用濾紙稱取,并連同濾紙置干燥的500ml凱氏燒瓶中;然后依次加入硫酸鉀(或無水硫酸鈉)10g和硫酸銅粉末0.5g,再沿瓶壁緩緩加硫酸20ml;在凱氏燒瓶口放一小漏斗并使凱氏燒瓶成45°斜置,用直火緩緩加熱,使溶液的溫度保持在沸點以下,等泡沸停止,強熱至沸騰,俟溶液成澄明的綠色后,除另有規定外,繼續加熱30分鐘,放冷。沿瓶壁緩緩加水250ml,振搖使混合,放冷后,加40%氫氧化鈉溶液75ml,注意使沿瓶壁流至瓶底,自成一液層,加鋅粒數粒,用氮氣球將凱氏燒瓶與冷凝管連接;另取2%硼酸溶液50ml,置500ml錐形瓶中,加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液10滴;將冷凝管的下端插入硼酸溶液的液面下,輕輕擺動凱氏燒瓶,使溶液混合均勻,加熱蒸餾,至接收液的總體積約為250ml時,將冷凝管尖端提出液面,使蒸氣沖洗約1分鐘,用水淋洗尖端后停止蒸餾;餾出液用硫酸滴定液(0.05mol/L)滴定至溶液由藍綠色變為灰紫色,并將滴定的結果用空白試驗校正。每1ml硫酸滴定液(0.05mol/L)相當于1.401mg的N。

5.2 第二法(半微量法)

蒸餾裝置如圖。圖中A為1000ml圓底燒瓶,B為安全瓶,C為連有氮氣球的蒸餾器,D為漏斗,E為直形冷凝管,F為100ml錐形瓶,G、H為橡皮管夾。

蒸餾裝置

圖 蒸餾裝置

連接蒸餾裝置,A瓶中加水適量與甲基紅指示液數滴,加稀硫酸使成酸性,加玻璃珠或沸石數粒,從D漏斗加水約50ml,關閉G夾,開放冷凝水,煮沸A瓶中的水,當蒸汽從冷凝管尖端冷凝而出時,移去火源,關H夾,使C瓶中的水反抽到B瓶,開G夾,放出B瓶中的水,關B瓶及G夾,將冷凝管尖端插入約50ml水中,使水自冷凝管尖端反抽至C瓶,再抽至B瓶,如上法放去。如此將儀器內部洗滌2~3次。

取供試品適量(約相當于含氮量1.0~2.0mg),精密稱定,置干燥的30~50ml凱氏燒瓶中,加硫酸鉀(或無水硫酸鈉)0.3g與30%硫酸銅溶液5滴,再沿瓶壁滴加硫酸2.0ml;在凱氏燒瓶口放一小漏斗,并使凱氏燒瓶成45°斜置,用小火緩緩加熱使溶液保持在沸點以下,等泡沸停止,逐步加大火力,沸騰至溶液成澄明的綠色后,除另有規定外,繼續加熱10分鐘,放冷,加水2ml。

取2%硼酸溶液10ml,置100ml錐形瓶中,加甲基紅-溴甲酚綠混合指示液5滴,將冷凝管尖端插入液面下。然后,將凱氏燒瓶中內容物經由D漏斗轉入C蒸餾瓶中,用水少量淋洗凱氏燒瓶及漏斗數次,再加入40%氫氧化鈉溶液10ml,用少量水再洗漏斗數次,關G夾,加熱A瓶進行蒸氣蒸餾,至硼酸液開始由酒紅色變為藍綠色時起,繼續蒸餾約10分鐘后,將冷凝管尖端提出液面,使蒸氣繼續沖洗約1分鐘,用水淋洗尖端后停止蒸餾。

餾出液用硫酸滴定液(0.005mol/L)滴定至溶液由藍綠色變為灰紫色,并將滴定的結果用空白試驗(空白和供試品所得餾出液的容積應基本相同,約70~75ml)校正。每1ml硫酸滴定液(0.005mol/L)相當于0.1401mg的N。

取用的供試品如在0.1g以上時,應適當增加硫酸的用量,使消解作用完全,并相應地增加40%氫氧化鈉溶液的用量。

6 附錄Ⅶ E 乙醇量測定法

本法系采用氣相色譜法2010年版藥典二部附錄Ⅴ E)測定制劑中在20℃時乙醇(C2H5OH)的含量(%,ml/ml)。除另有規定外,按下列方法測定。

6.1 第一法(毛細管柱法)

6.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

用鍵合交聯聚乙二醇為固定液的毛細管柱;起始溫度為50℃,維持7分鐘,再以每分鐘10℃的速率升溫至110℃;進樣口溫度190℃;檢測器溫度220℃。理論板數按正丙醇峰計算應不低于8000,乙醇峰與正丙醇峰的分離度應大于2.0。

6.1.2 校正因子測定

精密量取恒溫至20℃的無水乙醇4ml、5ml、6ml,分別置100ml量瓶中,分別精密加入恒溫至20℃的正丙醇(內標物質)5ml,用水稀釋至刻度,搖勻,精密量取上述各溶液1ml,分別置100ml量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻(必要時可進一步稀釋),作為對照品溶液。取上述三種溶液各適量,注入氣相色譜儀,分別連續進樣3次,測定峰面積,計算校正因子,所得校正因子的相對標準偏差不得大于2.0%。

6.1.3 測定法

精密量取恒溫至20℃的供試品適量(相當于乙醇約5ml),置100ml量瓶中,精密加入恒溫至20℃的正丙醇5ml,用水稀釋至刻度,搖勻,精密量取該溶液1ml,置100ml量瓶中,用水稀釋至刻度,搖勻(必要時可進一步稀釋),作為供試品溶液。取1μl注入氣相色譜儀,測定,即得。

6.2 第二法(填充柱法)

6.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

用直徑為0.18~0.25mm的二乙烯苯-乙基乙烯苯型高分子多孔小球作為載體;柱溫為120~150℃。理論板數按正丙醇峰計算應不低于700,乙醇峰與正丙醇峰的分離度應大于2.0。

6.2.2 校正因子測定

精密量取恒溫至20℃的無水乙醇4ml、5ml、6ml,分別置100ml量瓶中,分別精密加入恒溫至20℃的正丙醇(內標物質)5ml,用水稀釋至刻度,搖勻(必要時可進一步稀釋)。取上述三種溶液適量,注入氣相色譜儀,分別連續進樣3次,測定峰面積,計算校正因子,所得校正因子的相對標準偏差不得大于2.0%。

6.2.3 測定法

精密量取恒溫至20℃的供試品溶液適量(相當于乙醇約5ml),置100ml量瓶中,精密加入恒溫至20℃的正丙醇5ml,用水稀釋至刻度,搖勻(必要時可進一步稀釋),取適量注入氣相色譜儀,測定,即得。

7 附錄Ⅶ F 甲氧基、乙氧基與羥丙氧基測定法

本法系采用氣相色譜法(2010年版藥典二部附錄Ⅴ E)或容量法測定甲基纖維素乙基纖維素、羥丙纖維素羥丙甲纖維素藥用輔料中所含的甲氧基、乙氧基和羥丙氧基。

可選擇第一法或第二法測定,當第二法測定結果不符合規定時,應以第一法測定結果為判定依據。

7.1 第一法(氣相色譜法)

7.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

用25%苯基-75%甲基聚硅氧烷為固定液,涂布濃度為20%的填充柱,或用6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷(或極性相近的固定液)為固定液的毛細管色譜柱;起始溫度為100℃,維持8分鐘,再以每分鐘50℃的速率升溫至230℃,維持2分鐘;進樣口溫度為200℃;檢測器(氫火焰離子化檢測器(FID)或熱導檢測器(TCD)]溫度為250℃。理論板數按正辛烷峰計算不低于1500(填充柱)或10000(毛細管柱),對照品峰與內標物質峰的分離度應符合要求。取對照品溶液1μl注入氣相色譜儀,連續迸樣5次,計算校正因子,相對標準偏差應不大于3.0%。

7.1.2 測定法

取供試品約65mg,精密稱定,置已稱重的反應瓶中(可取10ml的頂空進樣瓶),加己二酸80mg,精密加入內標溶液(取正辛烷0.5g,置100ml量瓶中,加鄰二甲苯溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得)與57%氫碘酸溶液各2ml,密封,精密稱定,于130~150℃振蕩60分鐘,或在130~150℃加熱30分鐘后,劇烈振搖5分鐘,繼續在130~150℃加熱30分鐘,冷卻,精密稱定,若減失重量小于反應瓶中內容物的0.50%,且無滲漏,可直接取混合液的上層液體作為供試品溶液;若減失重量大于反應瓶中內容物的0.50%,則應按上法重新制備供試品溶液。另取己二酸80mg,置已稱重的反應瓶中,精密加入內標溶液與57%氫碘酸溶液各2ml,密封,精密稱定,根據供試品中所含甲氧基、乙氧基和羥丙氧基的量,用注射器穿刺加入相應的碘甲烷碘乙烷和2-碘丙烷對照品,精密稱定,兩次稱重結果相減即為對照品的加入量。振搖約30秒鐘,靜置,取上層液體作為對照品溶液。取供試品溶液與對照品溶液各1μl,分別注入氣相色譜儀,記錄色譜圖,按內標法以峰面積計算,并將結果乘以系數[碘甲烷(分子量141.94)轉換為甲氧基(分子量31.03)系數為0.2186;碘乙烷(分子量155.97)轉換為乙氧基(分子量45.06)系數為0.2889;2-碘丙烷(分子量169.99)轉換為羥丙氧基(分子量75.09)系數為0.4417],即得。

7.2 第二法(容量法)

7.2.1 1.羥丙氧基測定

7.2.1.1 儀器裝置

如圖1。圖中D為25ml雙頸蒸餾瓶,側頸與外裹鋁箔的長度為95mm的分餾柱E相連接;C為接流管,末端內徑為0.25~1.25mm,插入蒸餾瓶內;B為蒸汽發生管(25mm×150mm),亦具末端內徑為0.25~1.25mm的氣體導人管,并與C相通;F為冷凝管,外管長100mm,與E連接;G為125ml具刻度的帶玻塞錐形瓶,供收集餾液用。D與B均浸入可控溫的電熱油浴A中,維持溫度為155℃。

羥丙氧基測定儀器裝置

圖1 羥丙氧基測定儀器裝置

7.2.1.2 測定法

取各品種項下規定量的供試品,精密稱定,置蒸餾瓶D中,加30% (g/g)三氧化鉻溶液10ml。于蒸汽發生管B中裝入水至近接頭處,連接蒸餾裝置。將B與D均浸入油浴中(可為甘油),使油浴液面與D瓶中三氧化鉻溶液的液面相一致。開啟冷卻水,必要時通入氮氣流并控制其流速為每秒鐘約1個氣泡。于30分鐘內將油浴升溫至155℃,并維持此溫度至收集餾液約50ml,將冷凝管自分餾柱上取下,用水沖洗,洗液并入收集液中加酚酞指示液2滴,用氫氧化鈉滴定液(0.02mol/L)滴定至pH值為6.9~7.1(用酸度計測定),記下消耗的容積V1(ml),而后加碳酸氫鈉0.5g與稀硫酸10ml,靜置至不再產生二氧化碳為止,加碘化鉀1.0g,密塞,搖勻,置暗處放置5分鐘,加淀粉指示液1ml,用硫代硫酸鈉滴定液(0.02mol/L)滴定至終點,記下消耗的容積V2(ml)。另做空白試驗,分別記下消耗的氫氧化鈉滴定液(0.02mol/L)與硫代硫酸鈉滴定液(0.02mol/L)的容積Va與Vb(ml),按下式計算,即得。

捕獲.JPG

式中 K為空白校正系數(M1Va)/(M2Vb);

V1為供試品消耗氫氧化鈉滴定液(0.02mol/L)的容積,ml;

V2為供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液(0.02mol/L)的容積,ml;

Va為空白試驗消耗氫氧化鈉滴定液(0.02mol/L)的容積,ml;

Vb為空白試驗消耗硫代硫酸鈉滴定液(0.02mol/L)的容積,ml;

W為供試品的重量,g;

M1為氫氧化鈉滴定液的濃度,mol/L;

M2為硫代硫酸鈉滴定液的濃度,mol/L;

0.0751為羥丙氧基(OCH2CHOHCH3)的毫摩爾質量

7.2.2 2.甲氧基測定

7.2.2.1 儀器裝置

如圖2。A為50ml圓底燒瓶,側部具一內徑為1mm的支管供導入二氧化碳或氮氣流用;瓶頸垂直裝有長約25cm、內徑為9mm的直形空氣冷凝管E,其上端彎曲成出

甲氧基測定儀器裝置

圖2 甲氧基測定儀器裝置

口向下、并縮為內徑2mm的玻璃毛細管,浸入內盛水約2ml的洗氣瓶B中;洗氣瓶具出口為一內徑約7mm的玻璃管,其末端為內徑4mm可拆卸的玻璃管,可浸入兩個相連接的接收容器C、D中的第一個容器C內液面之下。

7.2.2.2 測定法

取干燥的供試品(相當于甲氧基10mg),精密稱定,置燒瓶中,加熔融苯酚2.5ml與氫碘酸5ml,連接上述裝置;另在兩個接收容器內,分別加入10%醋酸鉀的冰醋酸溶液6ml與4ml,再各加溴0.2ml;通過支管將CO2或N2氣流緩慢而均衡地(每秒鐘1~2個氣泡為宜)通入燒瓶,緩緩加熱使溫度控制在恰使沸騰液體的蒸氣上升至冷凝管的半高度(約至30分鐘使油液溫度上升至135~140℃),在此溫度下通常在45分鐘可完成反應(根據供試品的性質而定,如果供試品中含有多于兩個甲氧基時,加熱時間應延長到1~3小時)。而后拆除裝置,將兩只接收容器的內容物傾入250ml碘瓶(內盛25%醋酸鈉溶液5ml)中,并用水淋洗使總體積約為125ml,加入甲酸0.3ml,轉動碘瓶至溴的顏色消失,再加入甲酸0.6ml,密塞振搖,使過量的溴完全消失,放置1~2分鐘,加入碘化鉀1.0g與稀硫酸5ml,用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定,并將滴定的結果用空白試驗校正。每1ml硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)相當于0.5172mg的甲氧基。

7.3 【注意事項】

(1)碘甲烷、碘乙烷和2-碘丙烷均為極易揮發性物質,應在進樣前,打開反應瓶密封蓋后,立即將上層液體移入進樣瓶;進樣瓶的密封性應良好。

(2)碘甲烷、碘乙烷和2-碘丙烷均應避光保存,放置過程中釋放出碘,使溶液顏色逐漸加深,每次測定前應進行標化(見附注),含量計算時應進行折算。

(3)57%氫碘酸可直接從市場購買,也可取市售的氫碘酸試劑置于全玻璃儀器中,加適量次亞磷酸,使氫碘酸的顏色由棕色變為無色,加熱,同時緩緩通入氮氣,收集126~127℃的餾分,純化后的氫碘酸貯藏于有良好密封性的棕色玻璃瓶中,充氮保存。

7.4 【附注】碘甲烷、碘乙烷和2-碘丙烷的標化

1.純度測定(氣相色譜法) 避光操作。用6%氰丙基苯基-94%二甲基硅氧烷(或極性相近的固定液)為固定液的毛細管柱;起始溫度為60℃,維持8分鐘,再以每分鐘10℃的速率升溫至150℃,維持10分鐘;進樣口溫度為200℃;檢測器[氫火焰離子化檢測(FID)或熱導檢測(TCD)]溫度為250℃。取本品1μl,注入氣相色譜儀,記錄色譜圖,按不加校正因子的峰面積歸一化法計算主峰相對百分含量,不得低于99.5%。

2.含量測定(容量法) 避光操作。取乙醇10ml,置100ml量瓶中,精密稱定,加碘甲烷(或碘乙烷,或2-碘丙烷)1.0ml,精密稱定,用乙醇稀釋至刻度,搖勻;精密量取20ml,置100ml量瓶中,精密加硝酸銀滴定液(0.1mol/L) 50ml與硝酸2ml,時時振搖2小時,避光,放置過夜,繼續時時振搖2小時,用水稀釋至刻度,搖勻,濾過,棄去初濾液20ml,精密量取續濾液50ml,加硫酸鐵銨指示液2ml,用硫氰酸銨滴定液(0.1mol/L)滴定,并將滴定結果用空白試驗校正。每1ml硝酸銀滴定液(0.1mol/L)相當于14.19mg的碘甲烷(CH3I)[15.60mg的碘乙烷(C2H5I)或17.00mg的2-碘丙烷(C3H7I)],含碘甲烷(或碘乙烷,或2-碘丙烷)不得低于98.0%。

8 附錄Ⅶ H 脂肪與脂肪油測定法

液體供試品如因析出硬脂發生渾濁時,應先置50℃的水浴上加熱,使完全熔化成澄清液體;加熱后如仍顯渾濁,可離心沉降或用干燥的保溫濾器濾過使澄清;將得到的澄清液體攪勻,趁其尚未凝固,用附有滴管的稱量瓶或附有玻勺的稱量杯,分別稱取下述各項檢驗所需的供試品。固體供試品應先在不高于其熔點10℃的溫度下熔化,離心沉降或濾過,再依法稱取。相對密度的測定 照相對密度測定法(2010年版藥典二部附錄Ⅵ A)測定。折光率的測定 照折光率測定法(2010年版藥典二部附錄Ⅵ F)測定。

8.1 熔點的測定

熔點測定法(2010年版藥典二部附錄Ⅵ C第二法)測定。

8.2 脂肪酸凝點的測定

(1)脂肪酸的提取 取20% (g/g)氫氧化鉀的甘油溶液75g,置800ml燒杯中,加供試品50g,于150℃在不斷攪拌下皂化15分鐘,放冷至約100℃,加入新沸的水500ml,攪勻,緩緩加入硫酸溶液(1→4)50ml,加熱至脂肪酸明顯分離為一個透明層;趁熱將脂肪酸移入另一燒杯中,用新煮沸的水反復洗滌,至洗液加入甲基橙指示液顯黃色,趁熱將澄清的脂肪酸放入干燥的小燒杯中,加無水乙醇5ml,攪勻,用小火加熱至無小氣泡逸出,即得。

(2)凝點的測定 取按上法制成的干燥脂肪酸,照凝點測定法(2010年版藥典二部附錄Ⅵ D)測定。

8.3 酸值的測定

酸值系指中和脂肪、脂肪油或其他類似物質1g中含有的游離脂肪酸所需氫氧化鉀的重量(mg),但在測定時可采用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)進行滴定。

酸值

稱重/g

酸值

稱重/g

0.5

10

100

1

1

5

200

0.5

10

4

300

0.4

50

2

除另有規定外,按表中規定的重量,精密稱取供試品,置250ml錐形瓶中,加乙醇-乙醚(1:1)混合液[臨用前加酚酞指示液1.0ml,用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)調至微顯粉紅色]50ml,振搖使完全溶解(如不易溶解,可緩慢加熱回流使溶解),用氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)滴定,至粉紅色持續30秒鐘不褪。以消耗氫氧化鈉滴定液(0.1mol/L)的容積(ml)為A,供試品的重量(g)為W,照下式計算酸值:

捕獲.JPG

滴定酸值在10以下的油脂時,可用10ml的半微量滴定管。

8.4 皂化值的測定

皂化值系指中和并皂化脂肪、脂肪油或其他類似物質1g中含有的游離酸類和酯類所需氫氧化鉀的重量(mg)。

取供試品適量[其重量(g)約相當于250/供試品的最大皂化值],精密稱定,置250ml錐形瓶中,精密加入0.5mol/L氫氧化鉀乙醇溶液25ml,加熱回流30分鐘,然后用乙醇10ml沖洗冷凝器的內壁和塞的下部,加酚酞指示液1.0ml,用鹽酸滴定液(0.5mol/L)滴定剩余的氫氧化鉀,至溶液的粉紅色剛好褪去,加熱至沸,如溶液又出現粉紅色,再滴定至粉紅色剛好褪去;同時做空白試驗。以供試品消耗的鹽酸滴定液(0.5mol/L)的容積(ml)為A,空白試驗消耗的容積(ml)為B,供試品的重量(g)為W,照下式計算皂化值:

捕獲.JPG

8.5 羥值的測定

羥值系指供試品1g中含有的羥基,經用下法酰化后,所需氫氧化鉀的重量(mg)。

羥值

稱重/g

羥值

稱重/g

10~100

2.0

200~250

0.75

100~150

1.5

250~300

0.60

150~200

1.0

除另有規定外,按表中規定的重量,精密稱取供試品,置干燥的250ml具塞錐形瓶中,精密加入酰化劑(取對甲苯磺酸14.4g,置500ml錐形瓶中,加乙酸乙酯360ml,振搖溶解后,緩緩加入醋酐120ml,搖勻,放置3日后備用)5ml,用吡啶少許濕潤瓶塞,稍擰緊,輕輕搖動使完全溶解,置50℃±1℃水浴中25分鐘(每10分鐘輕輕搖動)后,放冷,加吡啶-水(3:5)20ml,5分鐘后加甲酚紅-麝香草酚藍混合指示液8~10滴,用氫氧化鉀(或氫氧化鈉)滴定液(1mol/L)滴定至溶液顯灰藍色或藍色;同時做空白試驗。以供試品消耗的氫氧化鉀(或氫氧化鈉)滴定液(1mol/L)的容積(ml)為A,空白試驗消耗的容積(ml)為B,供試品的重量(g)為W,供試品的酸值為D,照下式計算羥值:

捕獲.JPG

8.6 碘值的測定

碘值系指脂肪、脂肪油或其他類似物質100g,當充分鹵化時所需的碘量(g)。

取供試品適量[其重量(g)約相當于25/供試品的最大碘值],精密稱定,置250ml的干燥碘瓶中,加三氯甲烷10ml,溶解后,精密加入溴化碘溶液25ml,密塞,搖勻,在暗處放置30分鐘。加入新制的碘化鉀試液10ml與水100ml,搖勻,用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定剩余的碘,滴定時注意充分振搖,待混合液的棕色變為淡黃色,加淀粉指示液1ml,繼續滴定至藍色消失;同時做空白試驗。以供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)的容積(ml)為A,空白試驗消耗的容積(ml)為B,供試品的重量(g)為W,照下式計算碘值:

捕獲.JPG

8.7 氧化值的測定

過氧化值系指每1000g供試品中含有的其氧化能力與一定量的氧相當的過氧化物量。

除另有規定外,取供試品5g,精密稱定,置250ml碘瓶中,加三氯甲烷-冰醋酸(2:3)混合液30ml,振搖溶解后,加入碘化鉀試液0.5ml,準確振搖萃取1分鐘,然后加水30ml,用硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)滴定,滴定時,注意緩慢加入滴定液,并充分振搖直至黃色幾乎消失,加淀粉指示液5ml,繼續滴定并充分振搖至藍色消失,同時做空白試驗。空白試驗中硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)的消耗量不得過0.1ml。供試品消耗硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)的容積(ml)為A,空白試驗消耗硫代硫酸鈉滴定液(0.01mol/L)的容積(ml)為B,供試品的重量(g)為W,照下式計算過氧化值:

捕獲.JPG

加熱試驗 取供試品約50ml,置燒杯中,在砂浴上加熱至280℃,升溫速率為每分鐘上升10℃,觀察油的顏色和其他性狀的變化。

8.8 雜質

取供試品約20g,精密稱定,置錐形瓶中,加石油醚(沸程60~90℃)20ml使溶解,用干燥至恒重的垂熔玻璃坩堝濾過(如溶液不易濾過,可添加石油醚適量),用石油醚洗凈殘渣和濾器,在105℃干燥至恒重;精密稱定,增加的重量即為供試品中雜質的重量。

8.9 水分與揮發物

取供試品約5g,置干燥至恒重的扁形稱量瓶中,精密稱定,在105℃干燥40分鐘取出,置干燥器內放冷,精密稱定重量;再在105℃干燥20分鐘,放冷,精密稱定重量,至連續兩次干燥后稱重的差異不超過0.001g,如遇重量增加的情況,則以增重前的一次重量為恒重。減失的重量,即為供試品中含有水分與揮發物的重量。

8.10 【附注】

溴化碘溶液 取研細的碘13.0g,置干燥的具塞玻瓶中,加冰醋酸1000ml,微溫使碘完全溶解;另用吸管插入法量取溴2.5ml(或在通風櫥中用架盤天平稱取7.8g),加入上述碘溶液中,搖勻,即得。為了確定加溴量是否合適,可在加溴前精密取出20ml,用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定,記下消耗的容積(ml);加溴后,搖勻,再精密取出20ml,加新制的碘化鉀試液10ml,再用硫代硫酸鈉滴定液(0.1mol/L)滴定,消耗的容積(ml)應略小于加溴前的2倍。

本液應置具塞玻瓶內,密塞,在暗處保存。

9 附錄Ⅶ J 維生素A測定法

本法是用紫外-可見分光光度法2010年版藥典二部附錄Ⅳ A)或高效液相色譜法(2010年版藥典二部附錄Ⅴ D)測定維生素A及其制劑中維生素A的含量,以單位表示,每單位相當于全反式維生素A醋酸酯0.344μg或全反式維生素A醇0.300μg。

測定應在半暗室中盡快進行。

9.1 第一法(紫外-可見分光光度法)

由于維生素A制劑中含有稀釋用油和維生素A原料藥中混有其他雜質,采用紫外-可見分光光度法測得的吸光度不

是維生素A獨有的吸收。在以下規定的條件下,非維生素A物質的無關吸收所引入的誤差可以用校正公式校正,以便得到正確結果。

校正公式采用三點法,除其中一點是在吸收峰波長處測得外,其他兩點分別在吸收峰兩側的波長處測定,因此儀器波長應準確,故在測定前,應對儀器波長進行校正。

測定法 取供試品適量,精密稱定,加環己烷溶解并定量稀釋制成每1ml中含9~15單位的溶液,照紫外-可見分光光度法(2010年版藥典二部附錄Ⅳ A),測定其吸收峰的波長,并在下表所列各波長處測定吸光度,計算各吸光度與波長328nm處吸光度的比值和波長328nm處的image001.png值。

波長/nm

吸光度比值

波長/nm

吸光度比值

300

0.555

340

0.811

316

0.907

360

0.299

328

1.000

如果吸收峰波長在326~329nm之間,且所測得各波長吸光度比值不超過表中規定的±0.02,可用下式計算含量:

每1g供試品中含有的維生素A的單位=image001.png(328nm)×1900如果吸收峰波長在326~329nm之間,但所測得的各波長吸光度比值超過表中規定值的±0.02,應按下式求出校正后的吸光度,然后再計算含量:

A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340

如果在328nm處的校正吸光度與未校正吸光度相差不超過±3.0%,則不用校正吸光度,仍以未經校正的吸光度計算含量。

如果校正吸光度與未校正吸光度相差在-15%至-3%之間,則以校正吸光度計算含量。

如果校正吸光度超出未校正吸光度的-15%至-3%的范圍,或者吸收峰波長不在326~329nm之間,則供試品須按下述方法測定。

另精密稱取供試品適量(約相當于維生素A總量500單位以上,重量不多于2g),置皂化瓶中,加乙醇30ml與50%氫氧化鉀溶液3ml,置水浴中煮沸回流30分鐘,冷卻后,自冷凝管頂端加水10ml沖洗冷凝管內部管壁,將皂化液移至分液漏斗中(分液漏斗活塞涂以甘油淀粉潤滑劑),皂化瓶用水60~100ml分數次洗滌,洗液并人分液漏斗中,用不含過氧化物的乙醚振搖提取4次,每次振搖約5分鐘,第一次60ml,以后各次40ml,合并乙醚液,用水洗滌數次,每次約100ml,洗滌應緩緩旋動,避免乳化,直至水層遇酚酞指示液不再顯紅色,乙醚液用鋪有脫脂棉與無水硫酸鈉的濾器濾過,濾器用乙醚洗滌,洗液與乙醚液合并,置250ml量瓶中,用乙醚稀釋至刻度,搖勻;精密量取適量,置蒸發皿內,微溫揮去乙醚,迅速加異丙醇溶解并定量稀釋制成每1ml中含維生素A 9~15單位,照紫外-可見分光光度法(2010年版藥典二部附錄Ⅳ A),在300nm、310nm、325nm與334nm四個波長處測定吸光度,并測定吸收峰的波長。吸收峰的波長應在323~327nm之間,且300nm波長處的吸光度與325nm波長處的吸光度的比值應不超過0.73,按下式計算校正吸光度:

A325(校正)=6.815A325-2.555A310-4.260A334

每1g供試品中含有的維生素A的單位=image001.png(325 nm,校正)×1830

如果校正吸光度在未校正吸光度的97%~103%之間,則仍以未經校正的吸光度計算含量。

如果吸收峰的波長不在323~327nm之間,或300nm波長處的吸光度與325nm波長處的吸光度的比值超過0.73,則應自上述皂化后的乙醚提取液250ml中,另精密量取適量(相當于維生素A 300~400單位),微溫揮去乙醚至約剩5ml,再在氮氣流下吹干,立即精密加入甲醇3ml,溶解后,精密量取500μl,注入維生素D測定法(2010年版藥典二部附錄Ⅶ K)第二法項下的凈化用色譜柱系統,準確收集含有維生素A的流出液,在氮氣流下吹干,而后照上述方法自“迅速加異丙醇溶解”起,依法操作并計算含量。

9.2 第二法(高效液相色譜法)

本法適用于維生素A醋酸酯原料及其制劑中維生素A的含量測定。

色譜條件與系統適用性試驗 用硅膠為填充劑,以正己烷-異丙醇(997:3)為流動相,檢測波長為325nm。取系統適用性試驗溶液10μl,注入液相色譜儀,維生索A醋酸酯主峰與其順式異構體峰的分離度應大于3.0。精密量取對照品溶液10μl,注入液相色譜儀,連續進樣5次,主成分峰面積的相對標準偏差不得過3.0%。

系統適用性試驗溶液的制備 取維生素A對照品適量(約相當于維生素A醋酸酯300mg),置燒杯中,加入碘試液0.2ml,混勻,放置約10分鐘,定量轉移至200ml量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,精密量取1ml,置100ml量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻。

測定法 精密稱取供試品適量(約相當于15mg維生素A醋酸酯),置100ml量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,精密量取5ml,置50ml量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,作為供試品溶液。另精密稱取維生索A對照品適量(約相當于15mg維生素A醋酸酯),同法制成對照品溶液。精密量取供試品溶液與對照品溶液各10μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標法以峰面積計算,含量應符合規定。

9.3 【附注】

(1)甘油淀粉潤滑劑 取甘油22g,加入可溶性淀粉9g,加熱至140℃,保持30分鐘并不斷攪拌,放冷,即得。

(2)不含過氧化物的乙醚 照麻醉乙醚項下的過氧化物檢查,如不符合規定,可用5%硫代硫酸鈉溶液振搖,靜置,分取乙醚層,再用水振搖洗滌1次,重蒸,棄去首尾5%部分,餾出的乙醚再檢查過氧化物,應符合規定。

(3)若維生素A對照品中含有維生素A醋酸酯順式異構體,則可直接用作系統適用性分離度考察,不必再做破壞性實驗。

10 附錄Ⅶ K 維生素D測定法

本法系用高效液相色譜法(2010年版藥典二部附錄Ⅴ D)測定維生素D(包括維生素D2和維生素D3,下同)及其制劑、維生素AD制劑或魚肝油中所含維生素D及前維生素D經折算成維生素D的總量,以單位表示,每單位相當于維生素D 0.025μg。

測定應在半暗室中及避免氧化的情況下進行。

無維生素A醇及其他雜質干擾的供試品可用第一法測定,否則應按第二法處理后測定;如果按第二法處理后,前維生素D峰仍受雜質干擾,僅有維生素D峰可以分離時,則應按第三法測定。

10.1 第一法

對照品貯備溶液的制備 根據各制劑中所含維生素D的成分,精密稱取相應的維生素D2或D3對照品25mg,置100ml棕色量瓶中,加異辛烷80ml,避免加熱,超聲處理1分鐘使完全溶解,用異辛烷稀釋至刻度,搖勻,作為貯備溶液(1);精密量取5ml,置50ml棕色量瓶中,用異辛烷稀釋至刻度,搖勻,充氮密塞,避光,0℃以下保存,作為貯備溶液(2)。測定維生素D2時,應另取維生素D3對照品25mg,同法制成維生素D3對照品貯備溶液,供系統適用性試驗用。

色譜條件與系統適用性試驗 用硅膠為填充劑;以正己烷-正戊醇(997:3)為流動相;檢測波長為254nm。量取維生素D3對照品貯備溶液(1) 5ml,置具塞玻璃容器中,通氮后密塞,置90℃水浴中加熱1小時,取出,迅速冷卻,加正己烷5ml,搖勻,置1cm具塞石英吸收池中,在2支8W主波長分別為254nm和365nm的紫外光燈下,將石英吸收池斜放成45°,并距燈管5~6cm,照射5分鐘,使溶液中含有前維生素D3、反式維生素D3、維生素D3和速甾醇D3;量取該溶液注入液相色譜儀,進樣5次,記錄峰面積,維生素D3峰的相對標準偏差應不大于2.0%;前維生素D3峰(與維生素D3相對保留時間約為0.5)與反式維生素D3峰(與維生素D3相對保留時間約為0.6)以及維生素D3峰與速甾醇D3峰(與維生素D3相對保留時間約為1.1)的分離度均應大于1.0。

響應因子測定 精密量取對照品貯備溶液(2) 5ml,置50ml量瓶中,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,作為對照品溶液;取10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,計算維生素D的響應因子f1

f1=c1/A1

式中C1為維生素D對照品溶液的濃度,μg/ml;

A1為對照品溶液色譜圖中維生素D峰的峰面積。

另精密量取對照品貯備溶液(2)[1] 5ml,置50ml量瓶中,加2,6-二叔丁基對甲酚結晶1粒,通氮排除空氣后,密塞,置90℃水浴中加熱1.5小時,取出,迅速冷卻,用正己烷稀釋至刻度,搖勻,作為混合對照品溶液;取10μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,計算前維生素D的響應因子f2。f2=(C1-f1A1)/A2

式中 C1為f1測定項下維生素D對照品溶液的濃度,

μg/ml;

f1為維生素D的響應因子;

A1為混合對照品溶液色譜圖中維生素D峰的峰面積;

A2為混合對照品溶液色譜圖中前維生素D峰的峰面積。

測定法 取該制劑項下制備的供試品溶液進行測定,按下列公式計算維生素D及前維生素D折算成維生素D的總量(ci)。

ci=f1Ai1+f2Ai2

式中Ai1為維生素D峰的峰面積;Ai2為前維生素D峰的峰面積。

10.2 第二法

供試品溶液A的制備 精密稱取供試品適量(相當于維生素D總量600單位以上,重量不超過2.0g),置皂化瓶中,加乙醇30ml、維生素C 0.2g與50%氫氧化鉀溶液3ml[若供試量為3g,則加50%氫氧化鉀溶液4ml],置水浴上加熱回流30分鐘,冷卻后,自冷凝管頂端加水10ml沖洗冷凝管內壁,將皂化液移至分液漏斗中,皂化瓶用水60~100ml分數次洗滌,洗液并入分液漏斗中,用不含過氧化物的乙醚振搖提取3次,第一次60ml,以后每次40ml,合并乙醚液,用水洗滌數次,每次約100ml,洗滌時應緩緩旋動,避免乳化,直至水層遇酚酞指示液不再顯紅色,靜置,分取乙醚提取液,加入干燥濾紙條少許振搖除去乙醚提取液中殘留的水分,分液漏斗及濾紙條再用少量乙醚洗滌,洗液與提取液合并,置具塞圓底燒瓶中,在水浴上低溫蒸發至約5ml,再用氮氣流吹干,迅速精密加入甲醇3ml,密塞,超聲處理助溶后,移入離心管中,離心,取上清液作為供試品溶液A。

凈化用色譜柱系統分離收集維生素D 精密量取上述供試品溶液A 500μl,注入以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的液相色譜柱,以甲醇-乙腈-水(50:50:2)為流動相進行分離,檢測波長為254nm,記錄色譜圖,維生素D與前維生素D應為重疊峰,并能與維生索A及其他雜質分開。準確收集含有維生素D及前維生素D混合物的全部流出液,置具塞圓底燒瓶中,用氮氣流迅速吹干,精密加入正己烷溶液適量,使每1ml中含維生素D 50~140單位,密塞,超聲處理使溶解,即得供試品溶液B。

測定法 取供試品溶液B,照第一法進行含量測定,進樣量為100~200μl。

10.3 第三法

供試品溶液的制備 取該制劑項下制備的供試品溶液A,按上述第二法凈化用色譜柱系統分離維生素D項下的方法處理,至“用氮氣流迅速吹干”后,加入異辛烷2ml溶解,通氮排除空氣后,密塞,置90℃水浴中,加熱1.5小時后,立即通氮在2分鐘內吹干,迅速精密加入正己烷2ml,溶解后,即得供試品溶液C。

對照品溶液的制備 精密量取對照品貯備溶液(1)適量,加異辛烷定量稀釋制成每1ml中約含維生素D 50單位,精密量取2ml,置具塞圓底燒瓶中,照供試品溶液制備項下的方法,自“通氮排除空氣后”起,依法操作,得對照品溶液。

測定法 照第一法項下的色譜條件,精密量取對照品溶液與供試品溶液C各200μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標法以峰面積計算維生素D的含量。

11 附錄Ⅶ L 2-乙基己酸測定法

本法系采用氣相色譜法(2010年版藥典二部附錄Ⅴ E)測定β-內酰胺類藥物中的2-乙基己酸的量。

11.1 色譜條件與系統適用性試驗

用聚乙二醇(PEG-20M)或極性相似的毛細管柱;柱溫為150℃;進樣口溫度為200℃;檢測器溫度為300℃。2-乙基己酸峰的理論板數應不低于5000,各色譜峰之間的分離度應大于2.0。取對照品溶液連續進樣5次,2-乙基己酸峰與內標峰面積之比的相對標準偏差應不大于5%。

11.2 內標溶液的制備

稱取3-環己丙酸約100mg,置100ml量瓶中,用環己烷溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得。

11.3 供試品溶液的制備

精密稱取供試品約0.3g,加33%鹽酸溶液4.0ml使溶解,精密加入內標溶液1ml,劇烈振搖1分鐘,靜置使分層(如有必要,可離心),取上層溶液作為供試品溶液。必要時可進行二次提取:分取出下層溶液,精密加入內標溶液1ml,劇烈振搖1分鐘,靜置使分層(如有必要,可離心),棄去下層溶液,合并上清液,作為供試品溶液。

11.4 對照品溶液的制備

精密稱取2-乙基己酸對照品75mg,置50ml量瓶中,用內標溶液溶解并稀釋至刻度,搖勻。精密量取1ml,加33%鹽酸溶液4.0ml,劇烈振搖1分鐘,靜置使分層(如有必要,可離心),取上層溶液作為對照品溶液。如供試品進行二次提取,對照品也相應進行二次提取:分取出下層溶液,加入內標溶液1ml,再劇烈振搖1分鐘,靜置分層(如有必要,可離心),棄去下層溶液,合并上清液,作為對照品溶液。

11.5 測定法

取對照品溶液與供試品溶液各1μl,分別注入氣相色譜儀,記錄色譜圖,按照以下公式計算2-乙基己酸的百分含量(%):

捕獲.JPG

式中AT為供試品溶液色譜圖中2-乙基己酸的峰面積;

AR為對照品溶液色譜圖中2-乙基己酸的峰面積;

IT為供試品溶液色譜圖中內標的峰面積;

IR為對照品溶液色譜圖中內標的峰面積;

MT為供試品的重量,g;

MR為2-乙基己酸對照品的重量,g。

12 附錄Ⅶ M 蛋白質含量測定法

組成蛋白質的基本單位氨基酸,氨基酸通過脫水縮合形成肽鏈,蛋白質是一條或多條多肽鏈組成的生物大分子。不同品種應針對自身蛋白質特性選擇適宜的測定方法并做相應方法學驗證,同時應盡可能選用與待測品種蛋白質結構相同或相近的蛋白質作對照品。

12.1 第一法 凱氏定氮法

本法系依據蛋白質為含氮的有機化合物,當與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化時使蛋白質分解分解的氨與硫酸結合生成硫酸銨。然后堿化蒸餾使氨游離,用硼酸液吸收后以硫酸滴定液滴定,根據酸的消耗量算出含氮量,再將含氮量乘以換算系數,即為蛋白質的含量。[1]

本法靈敏度較低,適用于0.2~2.0mg氮的測定。氮轉化成蛋白質的換算系數因蛋白質中所含氨基酸的結構差異會稍有區別。

供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備。測定法 除另有規定外,按測定法(1)操作。

(1)本測定法適用于不含無機含氮物質及有機非蛋白質含氮物質的供試品。精密量取各品種項下規定的供試品溶液適量,置凱氏定氮瓶中,照氮測定法(2010年版藥典二部附錄Ⅶ D 第二法)測定供試品溶液的含氮量,除另有規定外,氮轉換為蛋白質的換算系數為6.25。

(2)本測定法適用于含有無機含氮物質及有機非蛋白質含氮物質的供試品。精密量取各品種項下規定的總氮量及非蛋白氮供試品溶液適量,分別置凱氏定氮瓶中,照氮測定法(2010年版藥典二部附錄Ⅶ D 第二法)測定,以總氮量減去非蛋白氮量即為供試品溶液的含氮量,除另有規定外,氮轉換為蛋白質的換算系數為6.25。

【附注】非蛋白氮供試品溶液制備的常用方法

鎢酸沉淀法 精密量取供試品適量(蛋白質含量不高于0.2g),置20ml量瓶中,加水10ml,加10%鎢酸鈉溶液2ml,0.33moI/L硫酸溶液2ml,加水至刻度,搖勻,靜置30分鐘,濾過,取續濾液,即得(可依據蛋白質濃度適當調整10%鎢酸鈉溶液及0.33mol/L硫酸溶液用量,使鎢酸終濃度保持1%)。三氯醋酸沉淀法 精密量取供試品適量(蛋白質含量約6~12mg),加等體積的10%三氯醋酸溶液,混勻,靜置30分鐘,濾過,取續濾液,即得(可依據蛋白質濃度適當調整10%三氯醋酸溶液用量,使三氯醋酸終濃度保持5%)。

12.2 第二法 福林酚法(Lowry法)

本法系依據蛋白質分子中含有的肽鍵在堿性溶液中與Cu2+螯合形成蛋白質-銅復合物,此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原,產生藍色化合物,同時在堿性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸色氨酸半胱氨酸還原呈藍色反應。在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比,以蛋白質對照品溶液作標準曲線,采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。

本法靈敏度高,測定范圍通常可達20~250μg。本法干擾物質較多,對雙縮脲反應產生干擾的離子,同樣容易干擾福林一酚反應,且影響還要大。還原物質、酚類、枸櫞酸、硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液甘氨酸甘露醇糖類、甘油等均有干擾作用。

試劑 堿性銅試液 取氫氧化鈉10g,碳酸鈉50g,加水400ml使溶解,作為甲液;取酒石酸鉀0.5g,加水50ml使溶解,另取硫酸銅0.25g,加水30ml使溶解,將兩液混合作為乙液。臨用前,合并甲、乙液,并加水至500ml。

對照品溶液的制備 除另有規定外,取牛血白蛋白對照品,加水溶解并制成每1ml中含0.2mg的溶液。

供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備(蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致)。

測定法 精密量取對照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分別置具塞試管中,各加水至1.0ml,再分別加入堿性銅試液1.0ml,搖勻,各加入福林酚試液[取福林試液中的貯備液(2mol/L酸濃度)1→16]4.0ml,立即混勻,置55℃水浴中準確反應5分鐘,置冷水浴10分鐘,照紫外-可見分光光度法(2010年版藥典二部附錄Ⅳ A),在650nm的波長處測定吸光度;同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量,同法測定。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度,并乘以稀釋倍數,即得。

12.3 第三法 雙縮脲法

本法系依據蛋白質分子中含有的兩個以上肽鍵在堿性溶液中與Cu2+形成紫紅色絡合物,在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比,以蛋白質對照品溶液作標準曲線,采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。

本法快速、靈敏度低,測定范圍通常可達1~10mg。本法干擾測定的物質主要有硫酸銨、三羥甲基氨基甲烷緩沖液和某些氨基酸等。

試劑 雙縮脲試液 取硫酸銅1.5g和酒石酸鉀鈉6.0g,加水500ml使溶解,邊攪拌邊加入10%氫氧化鈉溶液300ml,用水稀釋至1000ml,混勻,即得。本試劑如有黑色沉淀出現,應重新配制。

對照品溶液的制備 除另有規定外,取牛血清白蛋白對照品,加水溶解并制成每1ml中含10mg的溶液。

供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備(蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致)。

測定法 精密量取對照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml,分別置具塞試管中,各加水至1.0ml,再分別加入雙縮脲試液4.0ml,立即混勻,室溫放置30分鐘,照紫外一可見分光光度法(2010年版藥典二部附錄Ⅳ A),在540nm的波長處測定吸光度;同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量,同法操作。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度,并乘以稀釋倍數,即得。

12.4 第四法 2,2'-聯喹啉-4.4'-二羧酸法(BCA法)

本法系依據蛋白質分子在堿性溶液中將Cu2+還原為Cu+,2,2'-聯喹啉-4,4'-二羧酸(BCA)與Cu+結合形成紫色復合物,在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比,以蛋白質對照品溶液作標準曲線,采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。

本法靈敏度較高,測定范圍通常可達80~400μg。本法測定的樣品中不能有還原劑和銅螯合物,否則影響測定。

試劑 銅-BCA試液取 2,2'-聯喹啉-4,4'-二羧酸鈉1g,無水碳酸鈉2g,酒石酸鈉0.16g,氫氧化鈉0.4g與碳酸氫鈉0.95g,加水使溶解成100ml,調節pH值至11.25,作為甲液;另取4%硫酸銅溶液作為乙液。臨用前取甲液100ml,加入乙液2ml,混勻,即得。

對照品溶液的制備 除另有規定外,取牛血清白蛋白對照品,加水溶解并制成每1ml中含0.8mg的溶液。

供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備(蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致)。

測定法 精密量取對照品溶液0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml,分別置具塞試管中,各加水至0.5ml,再分別加入銅-BCA試液10.0ml,立即混勻,置37℃水浴中保溫30分鐘,放冷,照紫外-可見分光光度法(2010年版藥典二部附錄Ⅳ A),立即在562nm的波長處測定吸光度;同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量,同法測定。從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度,并乘以稀釋倍數,即得。

12.5 第五法 考馬斯亮藍法(Bradford法)

本法系依據在酸性溶液中考馬斯亮藍G250與蛋白質分子中的堿性氨基酸(精氨酸)和芳香族氨基酸結合形成藍色復合物,在一定范圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比,以蛋白質對照品溶液作標準曲線,采用比色法測定供試品中蛋白質的含量。

本法靈敏度高,通常可測定1~200μg的蛋白量。本法主要的干擾物質有去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉SDS)等,樣品緩沖液呈強堿性時也會影響顯色。

試劑 酸性染色液 取考馬斯亮藍G250 0.1g,加乙醇50ml溶解后,加磷酸100ml,加水稀釋至1000ml,混勻。濾過,取濾液,即得。本試劑應置棕色瓶內,如有沉淀產生,使用前再濾過。

對照品溶液的制備 除另有規定外,取牛血清白蛋白對照品,加水溶解并制成每1ml中含1mg的溶液。

供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備(蛋白質濃度應與對照品溶液基本一致)。

測定法 精密量取對照品溶液0.0ml、0.01ml、0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.1ml分別置具塞試管中,各加水至0.1ml,再分別加入酸性染色液5.0ml,立即混勻,照紫外-可見分光光度法(2010年版藥典二部附錄Ⅳ A),立即在595nm的波長處測定吸光度;同時以0號管作為空白。以對照品溶液濃度與其相對應的吸光度計算線性回歸方程。另精密量取供試品溶液適量,同法測定,從線性回歸方程計算供試品溶液中的蛋白質濃度,

并乘以稀釋倍數,即得。

【注意事項】本法測定時不可使用可與染色物結合的比色皿(如石英比色皿),建議使用玻璃比色皿或其他適宜材料的比色皿。

12.6 第六法 紫外-可見分光光度法

本法系依據蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸,其在280nm的波長處具最大吸光度,在一定范圍內其吸光度大小與蛋白質濃度呈正比。

本法操作簡便快速,適用于純化蛋白質的微量檢測,一般樣品濃度為0.2~2mg/ml。本法準確度較差,干擾物質多。測定法(2)適用于供試品溶液中存在核酸時的蛋白質測定。對照品溶液與供試品溶液的制備 照各品種項下規定的方法制備。

測定法

(1)取供試品溶液,照紫外-可見分光光度法(2010年版藥典二部附錄Ⅳ A),在280nm的波長處測定吸光度,以吸收系數法或對照品比較法計算供試品中蛋白質的含量。

(2)取供試品溶液,照紫外-可見分光光度法(2010年版藥典二部附錄Ⅳ A),在280nm與260nm的波長處測定吸光度,按下式計算供試品中蛋白質的含量。

蛋白質濃度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260

13 附錄Ⅶ N 合成多肽中的醋酸測定法

本法系用高效液相色譜法[1]測定合成多肽中醋酸或醋酸鹽的含量。除另有規定外,按下列方法測定。

13.1 對照品溶液的制備

取冰醋酸適量,精密稱定,用流動相A-流動相B(95:5)的混合溶液定量稀釋制成每1ml中約含0.1mg的溶液(對照品溶液的濃度可隨供試品中醋酸的含量作適當調整)。

13.2 供試品溶液的制備

照各品種項下規定的方法制備(取樣量應根據其醋酸含量而定)。

13.3 色譜條件及系統適用性試驗

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(250mm×4.6mm,5μm);以磷酸溶液(在1000ml水中加磷酸0.7ml,用0.42%氫氧化鈉溶液調節pH值至3.0)為流動相A;甲醇為流動相B;流速為每分鐘1.2ml;檢測波長為210nm。[1]按下表進行梯度洗脫。理論板數按醋酸峰計算應不低于2000。醋酸峰的保留時間約在3~4分鐘。梯度洗脫開始后,多肽被洗脫,基線急劇升高。

時間/分

流動相A/%

流動相B/%

0~5

5~10

10~20

20~22

22~30

95

50

50

95

95

5

50

50

5

5

13.4 測定法

精密量取對照品溶液和供試品溶液各10μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖,按外標法以峰面積計算多肽中醋酸的含量。

14 參考資料

  1. ^ [1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版:第一增補本[M].北京:中國醫藥科技出版社,2010.

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    2019/10/14 14:15:15 | #0
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