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2010年版藥典二部附錄Ⅳ

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1 拼音

2010 nián bǎn yào diǎn èr bù fù lù Ⅳ

中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄Ⅳ 分光光度法

分光光度法是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內的吸光度或發光強度,對該物質進行定性定量分析方法

常用的波長范圍為:(1) 200~400nm的紫外光區;(2)400~760nm的可見光區;(3)760~2500nm的近紅外光區;(4)2.5~25μm(按波數計為4000~400cm-1)的中紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見分光光度計(或比色計)、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量精密度準確度,所用儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定,定期進行校正檢定。

色光輻射穿過被測物質溶液時,在一定的濃度范圍內被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度(光路長度)成正比,其關系如下式:

捕獲.JPG

式中A為吸光度;

T為透光率;

E為吸收系數,采用的表示方法是(捕獲.JPG),其物理意義為當溶液濃度為1% (g/ml),液層厚度為1cm時的吸光度數值

c為100ml溶液中所含被測物質的重量(按干燥品或無水物計算),g;

l為液層厚度,cm。

物質對光的選擇性吸收波長,以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數后,可用同樣條件將該供試品配成溶液,測定其吸光度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區,除某些物質對光有吸收外,很多物質本身并沒有吸收,但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定,故又稱比色分析

2 附錄Ⅳ A 紫外-可見分光光度法

2.1 儀器的校正和檢定

1.波長 由于環境因素對機械部分的影響,儀器的波長經常會略有變動,因此除應定期對所用的儀器進行全面校正檢定外,還應于測定前校正測定波長。常用汞燈中的較強譜線237.83nm, 253.65nm, 275.28nm, 296.73nm, 313.16nm,334.15nm, 365.02nm, 404.66nm, 435.83nm, 546.07nm與576.96nm;或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進行校正;鈥玻璃在波長279.4nm,287.5nm,333.7nm,360.9nm,418.5nm,460.0nm,484.5nm,536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰,也可作波長校正用,但因來源不同或隨著時間的推移會有微小的變化,使用時應注意;近年來,常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器,以10%高氯酸溶液為溶劑,配制含氧化鈥(Ho2O3)4%的溶液,該溶液的吸收峰波長為241.13nm,278.10nm, 287.18nm, 333.44nm, 345.47nm, 361.31nm, 416.28nm,451.30nm,485.29nm,536.64nm和640.52nm。

儀器波長的允許誤差為:紫外光區±1nm,500nm附近±2nm。

2.吸光度的準確度 可用重鉻酸鉀硫酸溶液檢定。取在120℃干燥至恒重基準重鉻酸鉀約60mg,精密稱定,用0.005mol/L硫酸溶液溶解并稀釋至1000ml,在規定的波長處測定并計算其吸收系數,并與規定的吸收系數比較,應符合表中的規定。

波長/nm

235(最小)

257(最大)

313(最小)

350(最大)

吸收系數(捕獲.JPG)的規定值

124.5

144.0

48.6

106.6

吸收系數(捕獲.JPG)的許可范圍

123.0~126.0

142.8~146.2

47.0~50.3

105.5~108.5

3.雜散光檢查 可按下表所列的試劑和濃度,配制成水溶液,置1cm石英吸收池中,在規定的波長處測定透光率,應符合表中的規定。

試劑

濃度/% (g/ml)

測定用波長/nm

透光率/%

碘化鈉

亞硝酸鈉

1.00

5.00

220

340

<0.8

<0.8

2.2 對溶劑的要求

含有雜原子的有機溶劑,通常均具有很強的末端吸收。因此,當作溶劑使用時,它們的使用范圍均不能小于截止使用波長。例如甲醇乙醇的截止使用波長為205nm。另外,當溶劑不純時,也可能增加干擾吸收。因此,在測定供試品前,應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求,即將溶劑置1cm石英吸收池中,以空氣為空白(即空白光路中不置任何物質)測定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度,在220~240nm范圍內不得超過0.40,在241~250nm范圍內不得超過0.20,在251~300nm范圍內不得超過0.10,在300nm以上時不得超過0.05。

2.3 測定法

測定時,除另有規定外,應以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照,采用1cm的石英吸收池,在規定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸光度,或由儀器在規定波長附近自動掃描測定,以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確。除另有規定外,吸收峰波長應在該品種項下規定的波長±2nm以內,并以吸光度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸光度讀數,以在0.3~0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半高寬度的十分之一,否則測得的吸光度會偏低;狹縫寬度的選擇,應以減小狹縫寬度時供試品的吸光度不再增大為準。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收,因此測定供試品的吸光度后應減去空白讀數,或由儀器自動扣除空白讀數后再計算含量。

當溶液的pH值對測定結果有影響時,應將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調成一致。

1.鑒別和檢查 分別按各品種項下規定的方法進行。

2.含量測定 一般有以下幾種方法。

(1)對照品比較法 按各品種項下的方法,分別配制供試品溶液和對照品溶液,對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規定量的100%±10%,所用溶劑也應完全一致,在規定的波長處測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后,按下式計算供試品中被測溶液的濃度

cX=(AX/AR)cR

式中cX為供試品溶液的濃度;

AX為供試品溶液的吸光度;

CR為對照品溶液的濃度;

AR為對照品溶液的吸光度。

(2)吸收系數法 按各品種項下的方法配制供試品溶液,在規定的波長處測定其吸光度,再以該品種在規定條件下的吸收系數計算含量。用本法測定時,吸收系數通常應大于100,并注意儀器的校正和檢定。

(3)計算分光光度法 計算分光光度法有多種,使用時應按各品種項下規定的方法進行。當吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時,波長的微小變化可能對測定結果造成顯著影響,故對照品和供試品的測試條件應盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。

(4)比色法 供試品本身在紫外-可見光區沒有強吸收,或在紫外光區雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度,可加入適當的顯色劑,使反應產物的最大吸收移至可見光區,這種測定方法稱為比色法。

用比色法測定時,由于顯色時影響顯色深淺的因素較多,應取供試品與對照品或標準品同時操作。除另有規定外,比色法所用的空白系指用同體積的溶劑代替對照品或供試品溶液,然后依次加入等量的相應試劑,并用同樣方法處理。在規定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸光度后,按上述(1)法計算供試品濃度。

當吸光度和濃度關系不呈良好線性時,應取數份梯度量的對照品溶液,用溶劑補充至同一體積,顯色后測定各份溶液的吸光度,然后以吸光度與相應的濃度繪制標準曲線,再根據供試品的吸光度在標準曲線上查得其相應的濃度,并求出其含量。

3 附錄Ⅳ C 紅外分光光度法

3.1 儀器及其校正

可使用傅里葉變換紅外光譜儀或色散型紅外分光光度計。用聚苯乙烯薄膜(厚度約為0.04mm)校正儀器,繪制其光譜圖,用3027cm-1,2851cm-1,1601cm-1,1028cm-1,907cm-1處的吸收峰對儀器的波數進行校正。傅里葉變換紅外光譜儀在3000cm-1附近的波數誤差應不大于±5cm-1,在1000cm-1附近的波數誤差應不大于±1cm-1

用聚苯乙烯薄膜校正時,儀器的分辨率要求在3110~2850cm-1范圍內應能清晰地分辨出7個峰,峰2851cm-1與谷2870cm-1之間的分辨深度不小于18%透光率,峰1583cm-1與谷1589cm-1之間的分辨深度不小于12%透光率。儀器的標稱分辨率,除另有規定外,應不低于2cm-1

3.2 供試品的制備及測定

1.原料藥鑒別 除另有規定外,應按照國家藥典委員會編訂的《藥品紅外光譜集》各卷收載的各光譜圖所規定的方法制備樣品。具體操作技術參見《藥品紅外光譜集》的說明。采用固體制樣技術時,最常碰到的問題是多晶現象,固體樣品的晶型不同,其紅外光譜往往也會產生差異。當供試品的實測光譜與《藥品紅外光譜集》所收載的標準光譜不一致時,在排除各種可能影響光譜的外在或人為因素后,應按該藥品光譜圖中備注的方法或各品種項下規定的方法進行預處理,再繪制光譜,比對。如未規定該品種供藥用的晶型或預處理方法,則可使用對照品,并采用適當的溶劑對供試品與對照品在相同的條件下同時進行重結晶,然后依法繪制光譜,比對。如已規定特定的藥用晶型,則應采用相應晶型的對照品依法比對。

當采用固體制樣技術不能滿足鑒別需要時,可改用溶液法繪制光譜后比對。

2.制劑鑒別 品種鑒別項下應明確規定制劑的前處理方法,通常采用溶劑提取法。提取時應選擇適宜的溶劑,以盡可能減少輔料的干擾,并力求避免導致可能的晶型轉變。提取的樣品再經適當干燥后依法進行紅外光譜鑒別。

3.多組分原料藥鑒別 不能采用全光譜比對,可借鑒【注意事項】“2(3)”的方法,選擇主要成分的若干個特征譜帶,用于組成相對穩定的多組分原料藥的鑒別。

4.晶型、異構體限度檢查或含量測定 供試品制備和具體測定方法均按各品種項下有關規定操作。

【注意事項】

1.各品種項下規定“應與對照的圖譜(光譜集××圖)一致”,系指《藥品紅外光譜集》各卷所載的圖譜。同一化合物的圖譜若在不同卷上均有收載時,則以后卷所載的圖譜為準。

2.藥物制劑經提取處理并依法繪制光譜,比對時應注意以下四種情況:

(1)輔料無干擾,待測成分的晶型不變化,此時可直接與原料藥的標準光譜進行比對;

(2)輔料無干擾,但待測成分的晶型有變化,此種情況可用對照品經同法處理后的光譜比對;

(3)待測成分的晶型不變化,而輔料存在不同程度的干擾,此時可參照原料藥的標準光譜,在指紋區內選擇3~5個不受輔料干擾的待測成分的特征譜帶作為鑒別的依據。鑒別時,實測譜帶的波數誤差應小于規定值的0.5%;

(4)待測成分的晶型有變化,輔料也存在干擾,此種情況一般不宜采用紅外光譜鑒別。

3.由于各種型號的儀器性能不同,供試品制備時研磨程度的差異或吸水程度不同等原因,均會影響光譜的形狀。因此,進行光譜比對時,應考慮各種因素可能造成的影響。

4 附錄Ⅳ D 原子吸收分光光度法

原子吸收分光光度法的測量對象是呈原子狀態的金屬元素和部分非金屬元素,系由待測元素燈發出的特征譜線通過供試品經原子化產生的原子蒸氣時,被蒸氣中待測元素的基態原子所吸收,通過測定輻射光強度減弱的程度,求出供試品中待測元素的含量。原子吸收分光光度法遵循分光光度法的吸收定律,一般通過比較對照品溶液和供試品溶液的吸光度,求得供試品中待測元素的含量。

4.1 對儀器的一般要求

所用儀器為原子吸收分光光度計,由光源、原子化器、單色器和檢測系統等組成,另有背景校正系統、自動進樣系統等。

1.光源 常用待測元素作為陰極的空心陰極燈。

2.原子化器 主要有四種類型:火焰原子化器、石墨爐原子化器、氫化物發生原子化器及冷蒸氣發生原子化器。

(1)火焰原子化器 由霧化器及燃燒燈頭等主要部件組成。其功能是將供試品溶液霧化成氣溶膠后,再與燃氣混合,進入燃燒燈頭產生的火焰中,以干燥、蒸發、離解供試品,使待測元素形成基態原子。燃燒火焰由不同種類的氣體混合物產生,常用乙炔-空氣火焰。改變燃氣和助燃氣的種類及比例可以控制火焰的溫度,以獲得較好的火焰穩定性和測定靈敏度。

(2)石墨爐原子化器 由電熱石墨爐及電源等部件組成。其功能是將供試品溶液干燥、灰化,再經高溫原子化使待測元素形成基態原子。一般以石墨作為發熱體,爐中通入保護氣,以防氧化并能輸送試樣蒸氣。

(3)氯化物發生原子化器 由氫化物發生器和原子吸收池組成,可用于砷、鍺、鉛、鎘、硒、錫、銻等元素的測定。其功能是將待測元素在酸性介質中還原成低沸點、易受熱分解的氫化物,再由載氣導入由石英管、加熱器等組成的原子吸收池,在吸收池中氫化物被加熱分解,并形成基態原子。

(4)冷蒸氣發生原子化器 由汞蒸氣發生器和原子吸收池組成,專門用于汞的測定。其功能是將供試品溶液中的汞離子還原成游離汞,再由載氣將汞蒸氣導入石英原子吸收池,進行測定。

3.單色器 其功能是從光源發射的電磁輻射分離出所需要的電磁輻射,儀器光路應能保證有良好的光譜分辨率和在相當窄的光譜帶(0.2nm)下正常工作的能力,波長范圍一般為190.0~900.0nm。

4.檢測系統 由檢測器、信號處理器和指示記錄器組成,應具有較高的靈敏度和較好的穩定性,并能及時跟蹤吸收信號的急速變化。

5.背景校正系統 背景干擾是原子吸收測定中的常見現象。背景吸收通常來源于樣品中的共存組分及其在原子化過程中形成的次生分子或原子的熱發射、光吸收和光散射等。這些干擾在儀器設計時應設法予以克服。常用的背景校正法有連續光源(在紫外光區通常用氘燈)、塞曼效應、自吸效應等。

在原子吸收分光光度分析中,必須注意背景以及其他原因引起的對測定的干擾。儀器某些工作條件(如波長、狹縫、原子化條件等)的變化可影響靈敏度、穩定程度和干擾情況。在火焰法原子吸收測定中可采用選擇適宜的測定譜線和狹縫、改變火焰溫度、加入絡合劑或釋放劑、采用標準加入法等方法消除干擾;在石墨爐原子吸收測定中可采用選擇適宜的背景校正系統、加入適宜的基體改進劑等方法消除干擾。具體方法應按各品種項下的規定選用。

4.2 測定法

第一法(標準曲線法) 在儀器推薦的濃度范圍內,制備含待測元素的對照品溶液至少3份,濃度依次遞增,并分別加入各品種項下制備供試品溶液的相應試劑,同時以相應試劑制備空白對照溶液。將儀器按規定啟動后,依次測定空白對照溶液和各濃度對照品溶液的吸光度,記錄讀數。以每一濃度3次吸光度讀數的平均值為縱坐標、相應濃度為橫坐標,繪制標準曲線。按各品種項下的規定制備供試品溶液,使待測元素的估計濃度在標準曲線濃度范圍內,測定吸光度,取3次讀數的平均值,從標準曲線上查得相應的濃度,計算元素的含量。

第二法(標準加入法) 取同體積按各品種項下規定制備的供試品溶液4份,分別置4個同體積的量瓶中,除(1)號量瓶外,其他量瓶分別精密加入不同濃度的待測元素對照品溶液,分別用去離子水稀釋至刻度,制成從零開始遞增的一系列溶液。按上述標準曲線法自“將儀器按規定啟動后”操作,測定吸光度,記錄讀數;將吸光度讀數與相應的待測元素加入量作圖,延長此直線至與含量軸的延長線相交,此交點與原點間的距離即相當于供試品溶液取用量中待測元素的含量(如圖)。再以此計算供試品中待測元素的含量。此法僅適用于第一法標準曲線呈線性并通過原點的情況。

標準加入法測定圖示

圖 標準加入法測定圖示

當用于雜質限度檢查時,取供試品,按各品種項下的規定,制備供試品溶液;另取等量的供試品,加入限度量的待測元素溶液,制成對照品溶液。照上述標準曲線法操作,設對照品溶液的讀數為α,供試品溶液的讀數為b,b值應小于(a-b)。

5 附錄Ⅳ E 熒光分析法

某些物質受紫外光或可見光照射激發后能發射出比激發光波長較長的熒光。物質的激發光譜和熒光發射光譜,可以用作該物質的定性分析。當激發光強度、波長、所用溶劑及溫度等條件固定時,物質在一定濃度范圍內,其發射光強度與溶液中該物質的濃度成正比關系,可以用作定量分析。熒光分析法的靈敏度一般較紫外-可見分光光度法為高,但濃度太高的溶液會有“自熄滅”作用,以及由于在液面附近溶液會吸收激發光,使發射光強度下降,導致發射光強度與濃度不成正比,故熒光分析法應在低濃度溶液中進行。

5.1 測定法

所用的儀器為熒光計或熒光分光光度計,按各品種項下的規定,選定激發光波長和發射光波長,并制備對照品溶液和供試品溶液。

通常熒光分析法都是在一定條件下,用對照品溶液測定熒光強度與濃度的線性關系。當線性關系良好時,可在每次測定前,用一定濃度的對照品溶液校正儀器的靈敏度;然后在相同的條件下,分別讀取對照品溶液及其試劑空白的熒光強度與供試品溶液及其試劑空白的熒光強度,用下式計算供試品濃度:

捕獲.JPG

式中cX為供試品溶液的濃度;

Cr為對照品溶液的濃度;

RX為供試品溶液的熒光強度;

RXb為供試品溶液試劑空白的熒光強度;

Rr為對照品溶液的熒光強度;

Rrb為對照品溶液試劑空白的熒光強度。

因熒光分析法中的濃度與熒光強度的線性較窄,故(RX-RXb)/(Rr-Rrb)應控制在0.5~2之間為宜,如若超過,應在調節溶液濃度后再測。

當濃度與熒光強度明顯偏離線性時應改用工作曲線法。對易被光分解或弛豫時間較長的品種,為使儀器靈敏度定標準確,避免因激發光多次照射而影響熒光強度,可選擇一種激發光和發射光波長與供試品近似而對光穩定的物質配成適當濃度的溶液,作為基準溶液,例如藍色熒光可用硫酸奎寧的稀硫酸溶液,黃綠色熒光可用熒光素鈉水溶液,紅色熒光可用羅丹明B水溶液等。在測定供試品溶液時選擇適當的基準溶液代替對照品溶液校正儀器的靈敏度。

5.2 【注意事項】

熒光分析法因靈敏度高,故應注意以下干擾因素。

(1)溶劑不純會帶入較大誤差,應先做空白檢查,必要時,應用玻璃磨口蒸餾器蒸餾后再用。

(2)溶液中的懸浮物對光有散射作用,必要時,應用垂熔玻璃濾器濾過或用離心法除去。

(3)所用的玻璃儀器與測定池等也必須保持高度潔凈。

(4)溫度對熒光強度有較大的影響,測定時應控制溫度一致。

(5)溶液中的溶氧有降低熒光作用,必要時可在測定前通入惰性氣體除氧。

(6)測定時需注意溶液的pH值和試劑的純度等對熒光強度的影響。

6 附錄Ⅳ F 火焰光度法

某些含堿金屬或堿土金屬元素的供試品溶液用噴霧裝置以氣溶膠形式引入火焰光源中,靠火焰的熱能將供試品元素原子化并激發出它們的特征光譜,通過光電檢測系統測量出待測元素特征譜線的強度可求出供試品中待測元素的含量。通常借比較對照品溶液和供試品溶液的發光強度,求得供試品中待測元素的含量。

6.1 對儀器的一般要求

所用儀器為火焰光度計,由燃燒系統、單色器和檢測系統等部件組成。

燃燒系統由噴霧裝置、燃燒燈以及供應燃料氣體和助燃氣體的裝置等組成。燃燒火焰通常是用空氣作助燃氣,用煤氣或液化石油氣等作燃料氣組成的火焰,即空氣-煤氣或空氣-液化石油氣火焰。

儀器某些工作條件(如火焰類型、火焰狀態、空氣壓縮機供應壓力等)的變化可影響靈敏度、穩定程度和干擾情況,應按各品種項下的規定選用。

6.2 測定法

火焰光度法用于含量測定及雜質限度檢查時,照原子吸收分光光度法(附錄ⅣD)中第一法、第二法進行測定與計算。

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